[發明專利]馬鈴薯病毒和類病毒檢測試劑盒及應用

無效

• 申請號: 200610156123.X
• 申請日: 2006-12-27
• 公開（公告）號: CN101210271A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 吳志明;謝曉亮;溫春秀;周巧梅;田偉;劉銘;馬占元;董文琦;高秀瑞
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 葉凡

1.一種馬鈴薯病毒和類病毒的復合RT-PCR檢測試劑盒，由組分I和組分II組成；組分I和組分II中的各試劑單獨分裝，組分I由將馬鈴薯病毒或類病毒RNA逆轉錄為cDNA第1鏈的必需試劑所組成，包括：逆轉錄酶、RNA酶抑制劑，dNTP混合物，檢測對象的cDNA第1鏈的互補引物，反應緩沖液；組分II由進行PCR擴增的必需試劑所組成，包括：PCR反應緩沖液，dNTP混合物，MgCl₂，Taq?DNA聚合酶，PCR復合引物組合；

其特征在于：所述的檢測對象的cDNA第1鏈的互補引物是由以下7個引物按照任意比例組成的混合物：SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：6、SEQ?IDNO：8、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：12和SEQ?ID?NO：14；

所述的PCR復合引物組合是由以下7對引物所組成：SEQ?ID?NO：1、SEQ?IDNO：2(引物對1)；SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4(引物對2)；SEQ?ID?NO：5、SEQID?NO：6(引物對3)；SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8(引物對4)；SEQ?ID?NO：9、SEQ?IDNO：10(引物對5)；SEQ?IDNO：11、SEQ?IDNO：12(引物對6)；SEQ?IDNO：13、SEQ?ID?NO：14(引物對7)。

2.按照權利要求1的RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述PCR復合引物組合中7對引物的組成比例是：引物對1∶引物對2∶引物對3∶引物對4∶引物對5∶引物對6∶引物對7＝1∶1∶2∶1∶2∶2∶0.5。

3.按照權利要求1的RT-PCR試劑盒，其特征在于：組分I的組成為：50μM合成cDNA第1鏈的引物0.5-5000μL，反應緩沖液1-5000μL，RNA酶抑制劑0.5-5000μL，10mmol·L^-1?dNTPs?0.2-5000μL，200?U·μL^-1?M-MLV反轉錄酶0.5-5000μL；組分II的組成為：PCR反應緩沖液1-5000μL，25mM?MgCl₂0.1-5000μL，10mM?dNTPs?0.1-5000μL，50μM?PCR復合引物組合0.1-5000μL，TaqDNA聚合酶0.1-5000μL。

4.按照權利要求1的RT-PCR試劑盒，其特征在于：組分I的組成為：50μM合成cDNA第1鏈的引物0.5-5000μL，反應緩沖液1-5000μL，40U·μL^-1RNA酶抑制劑0.5-5000μL，10mmol·L^-1?dNTPs?0.2-5000μL，200U·μL^-1M-MLV反轉錄酶0.5-5000μL；組分II的組成為：PCR反應緩沖液1-5000μL，25mM?MgCl₂?0.1-5000μL，10mM?dNTPs?0.1-5000μL，50μM?PCR復合引物組合0.1-5000μL，Taq?DNA聚合酶0.1-5000μL。

5.按照權利要求1的RT-PCR試劑盒，其特征在于：組分I中還包括無RNA酶的去離子水；組分II中還包括有馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒混合物的無侵染活性的陽性對照。

6.權利要求1的RT-PCR試劑盒在檢測馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒中的應用，包括：(1)將馬鈴薯待檢樣品RNA用組分1的試劑按照常規的反應條件逆轉錄合成cDNA第1鏈；(2)將cDNA第1鏈用組分II的試劑按照常規的反應條件進行PCR擴增；(3)結果判定：將PCR擴增產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳；如果樣品僅擴增出了190?bp片段，則為健康樣品；若樣品無190?bp的DNA帶出現，則為假陰性樣品，需要繼續進行檢測確定；若樣品擴增產物中，190?bp片段和其它片段同時出現，則為感病樣品，其中馬鈴薯X病毒的擴增帶為520?bp，馬鈴薯Y病毒的擴增帶為420?bp，馬鈴薯A病毒的擴增帶為410?bp，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的擴增帶為360?bp，馬鈴薯S病毒的擴增帶為310?bp，馬鈴薯卷葉病毒的擴增帶為270?bp。