[發明專利]一種微生物轉化制備(R)－3－羥基丁酸乙酯的方法

無效

• 申請號: 200610155720.0
• 申請日: 2006-12-31
• 公開（公告）號: CN101210258A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 王普;何軍邀;歐志敏;周鶯
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12N1/16;C12R1/85
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;袁木棋

(一)技術領域

本發明涉及一種微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，屬于生物催化技術領域。

(二)背景技術

3-羥基丁酸乙酯(ethy-3-hydroxybutyrate，EHB)是一種重要的藥物中間體，分子中含有多功能基團，其手性單一對映異構體(R)-EHB和(S)-EHB羥基丁酸乙酯均是非常有前景的重要的手性砌塊，例如(S)-EHB是熏衣草醇、食菌甲誘醇、核球殼菌、格哈菌素、卡包霉素和灰綠霉素前體等天然產物的手性源，(R)-EHB也是合成L-肉堿、亞胺培南等碳青霉烯類抗生素等手性藥物的重要中間體。

由于乙酰乙酸乙酯(ethyl?3-oxobutanoate/ethyl?acetoacetate，EOB)易于合成且價格低廉，以其為底物進行微生物催化的不對稱還原反應獲取手性EHB是非常經濟有效的制備途徑。而且反應產物(R)-EHB不易為微生物代謝利用，用微生物活細胞催化方法制備(R)-EHB非常有利。

目前所知的從EOB還原為手性醇的方法主要有三條路徑：

(1)化學法。化學法采用的主要是過渡金屬配合物作為催化劑催化C＝O基加氫生成產物。化學法可獲得較高的產率，但主要缺點是反應的立體選擇性偏低，且手性催化劑的制備比較困難。

(2)直接利用醇脫氫酶催化乙酰乙酸乙酯。這種方法不僅要有酶蛋白參加反應，而且還要添加價格昂貴的輔酶因子，在實際應用中受到一定的限制。

(3)微生物全細胞生物轉化法(Biotransformation)。即通過完整的微生物細胞(如面包酵母)的立體選擇性生物催化來實現，微生物細胞含有完整的酶系，例如酵母細胞中含有醇脫氫酶系，可以實現輔酶的原位再生，不需要另外添加昂貴的輔酶因子，但現有已知可用于乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(R)-EHB的菌種(如紅酵母、產骯假絲酵母、活性干酵母假絲酵母等)，轉化率普遍較低(低于50％)。

(三)發明內容

本發明即是為了提供一種產率高、所得產物光學純度高、產物濃度高的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法。

為達到發明目的本發明采用的技術方案是：

一種微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯為底物，以膜醭畢赤酵母(Pichia?membranaef?aciens?Hansen)細胞為酶源，進行微生物催化不對稱還原反應，反應結束后轉化液經分離純化得到所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯。

所述膜醭畢赤酵母細胞來自：膜醭畢赤酵母經發酵培養獲得的發酵液或由發酵液過濾得到的濕菌體。可將濕菌體加入含有底物的溶液中，或直接按需要量將底物加入發酵液中，作為反應體系。

所述的微生物細胞催化的不對稱還原反應的反應溫度為20～50℃，反應時間為1～40小時。在此條件下所得的轉化液采用氣相色譜分析(GC)測定產物濃度，再結合產物的旋光測定得到產物e.e.值，表明已轉化的主要組分為(R)-EHB。

所述底物質量濃度為1～50％，加入發酵產物使濕菌體量為0.3～6g/g底物，所述不對稱還原反應的反應溫度為20～50℃，反應時間為1～40小時。

所述反應體系還可添加葡萄糖，添加量為0.1～25g/L。

優選的，所述不對稱還原反應在0.1M，pH?8.0的磷酸緩沖液中進行。

所述的發酵產物按如下方法制得：在發酵培養基中接種膜醭畢赤酵母菌種，接種量體積比5～10％，溫度20～40℃，培養1～5天后，得發酵液、或將發酵液過濾得所述濕菌體。