[發(fā)明專(zhuān)利]一種微生物轉(zhuǎn)化制備(R)－3－羥基丁酸乙酯的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610155720.0
• 申請(qǐng)日: 2006-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101210258A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王普;何軍邀;歐志敏;周鶯
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P7/62
• 分類(lèi)號(hào): C12P7/62;C12N1/16;C12R1/85
• 代理公司: 杭州天正專(zhuān)利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 黃美娟;袁木棋

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域。

(二)背景技術(shù)

3-羥基丁酸乙酯(ethy-3-hydroxybutyrate，EHB)是一種重要的藥物中間體，分子中含有多功能基團(tuán)，其手性單一對(duì)映異構(gòu)體(R)-EHB和(S)-EHB羥基丁酸乙酯均是非常有前景的重要的手性砌塊，例如(S)-EHB是熏衣草醇、食菌甲誘醇、核球殼菌、格哈菌素、卡包霉素和灰綠霉素前體等天然產(chǎn)物的手性源，(R)-EHB也是合成L-肉堿、亞胺培南等碳青霉烯類(lèi)抗生素等手性藥物的重要中間體。

由于乙酰乙酸乙酯(ethyl?3-oxobutanoate/ethyl?acetoacetate，EOB)易于合成且價(jià)格低廉，以其為底物進(jìn)行微生物催化的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)獲取手性EHB是非常經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑。而且反應(yīng)產(chǎn)物(R)-EHB不易為微生物代謝利用，用微生物活細(xì)胞催化方法制備(R)-EHB非常有利。

目前所知的從EOB還原為手性醇的方法主要有三條路徑：

(1)化學(xué)法。化學(xué)法采用的主要是過(guò)渡金屬配合物作為催化劑催化C＝O基加氫生成產(chǎn)物。化學(xué)法可獲得較高的產(chǎn)率，但主要缺點(diǎn)是反應(yīng)的立體選擇性偏低，且手性催化劑的制備比較困難。

(2)直接利用醇脫氫酶催化乙酰乙酸乙酯。這種方法不僅要有酶蛋白參加反應(yīng)，而且還要添加價(jià)格昂貴的輔酶因子，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。

(3)微生物全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法(Biotransformation)。即通過(guò)完整的微生物細(xì)胞(如面包酵母)的立體選擇性生物催化來(lái)實(shí)現(xiàn)，微生物細(xì)胞含有完整的酶系，例如酵母細(xì)胞中含有醇脫氫酶系，可以實(shí)現(xiàn)輔酶的原位再生，不需要另外添加昂貴的輔酶因子，但現(xiàn)有已知可用于乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱(chēng)還原制備(R)-EHB的菌種(如紅酵母、產(chǎn)骯假絲酵母、活性干酵母假絲酵母等)，轉(zhuǎn)化率普遍較低(低于50％)。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明即是為了提供一種產(chǎn)率高、所得產(chǎn)物光學(xué)純度高、產(chǎn)物濃度高的微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法。

為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種微生物轉(zhuǎn)化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯為底物，以膜醭畢赤酵母(Pichia?membranaef?aciens?Hansen)細(xì)胞為酶源，進(jìn)行微生物催化不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯。

所述膜醭畢赤酵母細(xì)胞來(lái)自：膜醭畢赤酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液或由發(fā)酵液過(guò)濾得到的濕菌體。可將濕菌體加入含有底物的溶液中，或直接按需要量將底物加入發(fā)酵液中，作為反應(yīng)體系。

所述的微生物細(xì)胞催化的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時(shí)間為1～40小時(shí)。在此條件下所得的轉(zhuǎn)化液采用氣相色譜分析(GC)測(cè)定產(chǎn)物濃度，再結(jié)合產(chǎn)物的旋光測(cè)定得到產(chǎn)物e.e.值，表明已轉(zhuǎn)化的主要組分為(R)-EHB。

所述底物質(zhì)量濃度為1～50％，加入發(fā)酵產(chǎn)物使?jié)窬w量為0.3～6g/g底物，所述不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時(shí)間為1～40小時(shí)。

所述反應(yīng)體系還可添加葡萄糖，添加量為0.1～25g/L。

優(yōu)選的，所述不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)在0.1M，pH?8.0的磷酸緩沖液中進(jìn)行。

所述的發(fā)酵產(chǎn)物按如下方法制得：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種膜醭畢赤酵母菌種，接種量體積比5～10％，溫度20～40℃，培養(yǎng)1～5天后，得發(fā)酵液、或?qū)l(fā)酵液過(guò)濾得所述濕菌體。