[發明專利]一種微生物轉化制備(R)－3－羥基丁酸乙酯的方法

無效

• 申請號: 200610155720.0
• 申請日: 2006-12-31
• 公開（公告）號: CN101210258A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 王普;何軍邀;歐志敏;周鶯
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12N1/16;C12R1/85
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;袁木棋

1.一種微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸乙酯為底物，以膜醭畢赤酵母(Pichia?membranaef?aciensHansen)細胞為酶源，進行微生物催化不對稱還原反應，反應結束后轉化液經分離純化得到所述的(R)-3-羥基丁酸乙酯。

2.如權利要求1所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述膜醭畢赤酵母細胞來自：膜醭畢赤酵母經發酵培養獲得的發酵液或由發酵液過濾得到的濕菌體。

3.如權利要求1或2所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述底物質量濃度為1～50％，加入發酵產物使濕菌體量為0.3～6g/g底物，所述不對稱還原反應的反應溫度為20～50℃，反應時間為1～40小時。

4.如權利要求3所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于：反應體系中添加有葡萄糖，添加量為0.1～25g/L。

5.如權利要求4所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述不對稱還原反應在0.1M，pH8.0的磷酸緩沖液中進行。

6.如權利要求1所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的發酵產物按如下方法制得：在發酵培養基中接種膜醭畢赤酵母菌種，接種量體積比5～10％，溫度20～40℃，培養1～5天后，得發酵液、或將發酵液過濾得所述濕菌體。

7.如權利要求6所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的發酵培養基各組分終濃度為：麥芽糖5～50g/L，酵母膏100～500g/L，NH₄Cl?1～10g/L、KH₂PO₄?0.5～5g/L，K₂HPO₄?0.5～5g/L，異于K⁺的金屬離子0.1～1g/L，pH值4～9。

8.如權利要求1所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的轉化液分離純化步驟為：用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層脫水、脫色后，回收溶劑，得到所述(R)-3-羥基丁酸乙酯。

9.如權利要求1所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進行：

(1)斜面培養：接種膜醭畢赤酵母菌株，斜面于28℃培養1～7天，作為斜面活化種子；

(2)種子培養：接入斜面活化種子，20～40℃，搖床轉速100～250r/min，培養1～5天，作為種子液；

(3)發酵培養：接種種子液，接種量5～10％體積比，20～40℃，搖床轉速100～250r/min，培養1～5天，得發酵液或濕菌體；

(4)微生物轉化：將發酵液或發酵液離心收集的濕菌體，用0.1M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液清洗后，將濕菌體轉入0.1M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時加入底物乙酰乙酸乙酯使底物質量濃度為1～50％，濕菌體用量為0.3～6g/g底物，并添加終濃度0.1～25g/L的葡萄糖，20～50℃、100～250r/min反應1～40小時，反應結束，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，再脫水、脫色，蒸發回收溶劑，得所述(R)-3-羥基丁酸乙酯。

10.如權利要求1所述的微生物轉化制備(R)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進行：

(1)斜面培養：培養基各組分終濃度為：麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L，pH6.5，121℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種膜醭畢赤酵母菌株，20～40℃培養1～7天，作為斜面活化種子；

(2)種子培養：培養基各組分終濃度為：麥芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH₄Cl?5g/L，KH₂PO₄?1g/L，K₂HPO₄?1g/L，MnSO₄·7H₂O0.5g/L，pH6.5，120℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接入斜面活化種子，20～40℃，搖床轉速100～250r/min，培養1～5天，作為種子液；

(3)發酵培養：培養基各組分終濃度為：麥芽糖30g/L，酵母膏2g/L，NH₄Cl?5g/L，KH₂PO₄?1g/L，K₂HPO₄?1g/L，MnSO₄·7H₂O0.5g/L，pH6.5，120℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接種種子液，接種量5～10％體積比，20～40℃，搖床轉速100～250r/min，培養1～5天，得發酵液；

(4)微生物轉化：將發酵液離心、收集菌體，用0.1M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液清洗后，將濕菌體轉入0.1M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時加入底物乙酰乙酸乙酯使底物質量濃度為1～50％，濕菌體用量為0.3～6g/g底物，并添加終濃度0.1～25g/L的葡萄糖，20～50℃、100～250r/min反應1～40小時，反應結束，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，再脫水、脫色，蒸發回收溶劑，得所述(R)-3-羥基丁酸乙酯。