[發明專利]一種高效檢測臨床樣品中結核分支桿菌復合體的方法

無效

• 申請號: 200610154887.5
• 申請日: 2006-11-28
• 公開（公告）號: CN101191145A
• 公開（公告）日: 2008-06-04
• 發明（設計）人: 薛樹仁
• 申請（專利權）人: 薛樹仁
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N33/50
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及臨床微生物核酸診斷技術領域，具體涉及一種靈敏度高、特異性強、高效檢測臨床樣品中結核分支桿菌核酸的技術，該技術還包括一種快速、高效液化痰的方法，而且液化過程對痰內分支桿菌無殺死作用。

背景技術

分支桿菌科只包括分支桿菌一個屬，按是否引起人和多種哺乳動物的結核病來區分，分支桿菌屬又分為結核分支桿復合體(mycobacterium?tuberculosis?complex，MTBC)和非結核分支桿菌(nontuberculosismycobacterium，NTM)；結核分支桿菌復合體包括結核分支桿菌(M.tuberculosis，MTB)、牛分支桿菌(M.bovis)、非洲分支桿菌(M.africanum)和田鼠分支桿菌(M.micoti)，結核分支桿菌和牛分支桿菌是引起人結核病的病原，非洲分支桿菌是引起非洲熱帶國家人結核病的病原。結核分支桿菌可存在于結核患者咳出的霧滴中，其大小為1～5μm，當易感人群吸入該顆粒并進入呼吸道末梢時可引起感染。在肺泡內結核分支桿菌可被巨噬細胞吞噬并向全身擴散，通常宿主細胞介導的免疫反應限制了結核分支桿菌的增殖與擴散。但有些結核分支桿菌在感染很多年內可保持休眠狀態。隱性感染結核分支桿菌的患者(即潛伏期感染患者)，通常純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗陽性，但無癥狀和無傳染性。通常隱性感染結核的患者有10％的可能轉化為活動性結核。

據中國疾病預防控制中心統計，2005年全國報告肺結核發病1259308人，死亡6713人，發病數和死亡數均居全國法定報告甲、乙、丙類傳染病發病數、死亡數第一位；而2004年肺結核發病970279人，死亡1435人，2005年與2004年相比，發病率增長29.03％。由以上統計數字看，我國肺結核病的防治工作仍然任重而道遠。

從全球范圍來看，世界上有三分之一的人口感染了潛伏性結核病，并面臨發展為活動性結核病的危險。在許多國家，艾滋病毒加快了結核病流行，同時多藥耐藥性也日益成為一大威脅。每年有170萬人死于結核病，其中許多死亡的原因是感染未能得到診斷或確診太晚以至于無法治愈。每年患活動性結核病的估計有900萬人，其中大多數仍未得到實驗室確認的診斷。每年采用最普遍的檢測方法——痰涂片顯微鏡檢查診斷和報告的結核病病例僅為大約220萬例。其它病例是通過一種往往效率低、有時還耗費資金的綜合方法來診斷，即肺部X線影像、細菌培養和推測。

因此，2006年10月25日，在日內瓦由熱帶病研究與培訓特別規劃(TDR)和促進創新診斷方法基金會發布的新報告《結核病診斷方法：全球需求和市場潛力》，其主要結論為：“在改進結核病檢測方面存在著一個相當大的尚未開發的全球市場，可供低收入和中等收入國家診斷結核病開展更為有效和更可負擔得起的檢測。今天大多數結核病例發生在這些國家。”

該報告認為，就目前所使用的診斷技術而言，在全世界結核病患者或生活在結核病高危地區的人當中，大多數人都很難獲得迅速而準確的檢測。這是因為：

第一，痰作為肺結核臨床檢測的主要標本，其液化方法至今沒有很好解決，因而結核分支桿菌核酸擴增檢測技術和分離培養難以診斷潛伏期感染患者。臨床上普遍使用的NaOH、NaOH-NALC、油酸、硫酸等方法雖然可以有效液化痰，但都很大程度(20～90％)地殺死痰樣品中的結核分支桿菌。臨床上涂片檢查要求每毫升痰液中桿菌的量至少為5×10³～1×10⁴，而分離培養要求10～100個桿菌，對于潛伏期結核分支桿菌感染患者每毫升痰液中桿菌的量一般在1×10³以下，涂片檢查顯然不適用，而痰經過液化之后損失大部分乃至全部的結核分支桿菌，造成核酸擴增和分離培養難以診斷潛伏期感染患者。而報告《結核病診斷方法：全球需求和市場潛力》指出，全球每年有2.04億人次需要作潛伏期感染檢測。

第二，痰涂片檢查、X線影像、培養檢測可能沒有準確地查明活動性結核病，尤其是艾滋病毒陽性患者。呼吸道和消化道是分支桿菌傳染人的主要途徑，結核臨床檢測標本包括痰、支氣管肺泡灌洗液和支氣管沖洗液、胃沖洗液、血、尿、糞、體液、組織等標本，艾滋病毒陽性患者通過消化道、血液等途徑感染分支桿菌之后顯然不能通過上述方法檢出桿菌。

第三，痰涂片檢查、X線影像、培養檢測可能無法嚴格區分潛伏性和活動性結核病，以及疾病對藥物的敏感性和耐藥性。