[發(fā)明專利]一種高效檢測臨床樣品中結核分支桿菌復合體的方法無效

申請?zhí)枺?/td>	200610154887.5	申請日：	2006-11-28
公開（公告）號：	CN101191145A	公開（公告）日：	2008-06-04
發(fā)明（設計）人：	薛樹仁	申請（專利權）人：	薛樹仁
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12Q1/04;G01N33/50
代理公司：	暫無信息	代理人：	暫無信息
地址：	310015浙江省杭州***	國省代碼：	浙江;33
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種高效檢測臨床樣品結核分支桿菌復合體方法
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【權利要求書】：

1.一種快速、有效液化痰的方法，根據該方法配制的液化試劑適用于結核病等呼吸道疾病的痰樣品前處理，它包括步驟：在臨床檢測的痰樣品中直接添加1～5倍體積的液化試劑，旋渦振蕩器上振蕩混勻30s～1min，室溫靜置15～20min，3000g～4000g離心15min，棄上清，沉淀用于下一步的核酸提取。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，根據所述的方法配制的液化試劑，其成分選自下組：0.5～1％的西吡氯銨，10～40％Na₃PO₄，0.1～5％的NALC，5～500mg/ml的溶菌酶，0.01～5％的DTT，5～500mg/ml的蛋白酶K，1～40％的NaCl，1～10％檸檬酸三鈉，0.001～1％NaN₃以及它們的混合物。

3.一種結核分支桿菌復合體熒光PCR擴增檢測方法，它包括步驟：在特異性擴增條件下，在熒光PCR擴增反應體系中進行PCR擴增反應和實時熒光檢測，檢測的熒光信號強弱與PCR產物的數量呈正比，反應結束以后通過設定熒光閾值來判定擴增產物是否存在，其特征在于，所述的反應體系中含有特異性擴增結核分支桿菌復合體核酸的引物對，還含有結核分支桿菌復合體特異性熒光探針。

4.一種檢測結核分支桿菌復合體的遺傳標記物，其特征在于，它具有SEQ?ID?NO：1中連續(xù)的80～300個核苷酸。

5.如權利要求3所述的方法，所述的特異性擴增結核分支桿菌復合體的引物對選自下組：

引物1：5’-CTA?CGC?AGC?AGA?TCC?CCA-3’，SEQ?ID?NO：2

引物2：5’-GCA?CCG?CCC?AAC?TCG?TT-3’??SEQ?ID?NO：3

引物1序列與SEQ?ID?NO：1所示的序列相同，引物2與SEQ?ID?NO：1所示的序列互補。

6.如權利要求3所述的方法，所述的結核分支桿菌復合體特異性熒光探針具有SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列。該探針是Taqman探針，并且可發(fā)出不同波長熒光。

7.一種高效檢測臨床樣品中結核分支桿菌復合體核酸的檢測方法，該方法將權利要求1所述的方法與權利要求3所述的方法結合并貫徹實施，包括以下步驟：

(1)痰樣品液化；

(2)樣品DNA提取；

(3)以抽提的DNA為模板，在熒光PCR擴增反應液中加入所述的特異性擴增結核分支桿菌復合體的引物對和所述的結核分支桿菌復合體特異性熒光探針，進行熒光PCR擴增反應；

(4)結果分析，反應結束以后通過設定熒光閾值來判定擴增產物是否存在，存在擴增產物就表示樣品中存在結核分支桿菌復合體。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于：含相同數量卡介苗菌的模擬臨床痰樣品與卡介苗稀釋菌液經痰液化以后作核酸提取和熒光PCR擴增檢測，結果顯示兩份樣品的C_t值相差小于1，表明雖然痰樣品經過液化步驟但是其中結核分支桿菌DNA沒有損失。卡介苗用1ml滅菌雙蒸水溶解，依次作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀釋，10^-2、10^-3、10^-4稀釋的100μl卡介苗菌液添加到1ml健康人痰作為模擬臨床樣品，與10^-2、10^-3、10^-4稀釋的100μl卡介苗菌液的檢測結果對照。