[發(fā)明專利]檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯片及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610147474.4
• 申請日: 2006-12-19
• 公開（公告）號: CN101205559A
• 公開（公告）日: 2008-06-25
• 發(fā)明（設計）人: 秦穎;肖華勝
• 申請（專利權）人: 上海生物芯片有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權代理有限公司
• 代理人: 陳履忠

技術領域

本發(fā)明涉及基因檢測芯片，尤其涉及一種檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯片及其應用。

背景技術

正常細胞功能的發(fā)揮與細胞本身的遺傳信息、遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控相關，隨著人類基因組計劃的實施，國內(nèi)外對基因組所攜帶的遺傳信息在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用已有比較深入的研究。相對而言，染色質(zhì)所攜帶的表觀遺傳信息在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用才剛開始被認識，表觀遺傳學基因組正在興起。表觀遺傳學的過程包括DNA甲基化，組蛋白的修飾和ATP依賴的染色質(zhì)的修飾，都可以引起基因表達的改變。其中DNA的甲基化是目前的一個研究熱點。

疾病發(fā)生、發(fā)展是細胞內(nèi)遺傳本身、遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控的紊亂。大量的臨床和基礎研究結果表明除了遺傳因素，環(huán)境因素在大多數(shù)疾病發(fā)生、發(fā)展中有巨大的影響，而表觀遺傳調(diào)控機制在遺傳因素和環(huán)境因素的互動關系中起了橋梁的作用，已有的研究結果表明表觀遺傳因素的作用占百分之七十左右。近年的研究更進一步指出表觀遺傳調(diào)控機制在多種疾病發(fā)生中起主導作用。基因表達的表觀遺傳調(diào)控是保證細胞內(nèi)基因的時空正確表達所必需的。因此，當表觀遺傳調(diào)控出現(xiàn)異常時，在胚胎發(fā)育階段可能引起各種先天性的發(fā)育缺陷，在成體階段可能造成各種疾病的發(fā)生。后基因組時代表觀遺傳學的興起為解開生命奧秘及征服疾病帶來了希望。

在哺乳類動物中，胞嘧啶的甲基化是惟一已知的DNA內(nèi)源性修飾方式，即通過DNA甲基轉移酶(DNA?methyl-transferase，Dnmt)的催化作用，將甲基基團加在胞嘧啶的5’C位置處。在哺乳類動物細胞中，大多數(shù)5’-甲基胞嘧啶(5mC)以雙核苷酸CpG的形式出現(xiàn)。CpG雙核苷酸在基因組中的分布很不均勻，其中密度較高的區(qū)域稱為CpG島(CpG?island)。以人類基因組為例，人類50％～60％的基因有CpG島，據(jù)估計整個基因組有45,000個CpG島，并且?guī)缀蹩偸俏挥诨騿幼雍?或)外顯子周圍。除了印記基因和女性失活的X染色體的幾個基因外，正常情況下，在CpG島的CpGs總是非甲基化的，而大多數(shù)CpG島之外的CpGs則是甲基化的。

DNA甲基化的機制及其作用尚未完全清楚，目前認為它與控制基因表達、DNA修復、外源基因的識別和剔除、以及染色體的穩(wěn)定性等相關。已證實，CpG島的甲基化可以直接導致相關基因的表觀遺傳學沉默，啟動子區(qū)域CpG島甲基化是與基因突變和缺失相并列的抑癌基因失活的第3種途徑，并成為近年來腫瘤研究的熱點之一。

隨著生物技術的進步，DNA甲基化的檢測手段日漸豐富，常用技術的基本原理主要可以歸納為四個方面：一種是依賴化學物質(zhì)對甲基化和非甲基化胞嘧啶的化學活性不同，將甲基修飾基團的差別轉變?yōu)閴A基序列的不同，從而加以分離；另一種是依賴甲基化和非甲基化胞嘧啶對特定的限制性內(nèi)切酶處理的不同反應而實現(xiàn)；第三種是依據(jù)差異性雜交的原理；第四種則是依靠甲基化CpG結合(methyl-CpG-binding?domain，MBD)蛋白家族對甲基化以及非甲基化的CpG序列的結合能力的不同進行分離。此外，還有單核苷酸法、甲基化接受力的檢測法等多種技術，這些技術極大地促進了表觀遺傳學的研究，推動了表觀基因組學研究的開展。目前雖然已經(jīng)存在較多的DNA甲基化的檢測技術，但是每種方法都有一定的局限性，難以達到大規(guī)模和全基因組范圍的分析，也不能檢測全基因組中甲基化或非甲基化DNA具體的CpG位點。現(xiàn)有的表觀基因組學急需要高通量，大規(guī)模的研究手段，全面地了解在疾病的發(fā)生過程中甲基化譜式的改變。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，能夠高通量、大規(guī)模地對全基因組DNA進行CpG島的檢測。為此，本發(fā)明還提供應用該寡核苷酸芯片進行檢測的方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)：

在本發(fā)明的一個方面，提供了一種檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，包括固相載體和探針，所述探針與全基因組中CpG島及CpG島上下游2kb區(qū)域的核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交。

所述探針的設計針對包括人類、大鼠、小鼠在內(nèi)的哺乳動物全基因組CpG島及CpG島上下游2kb區(qū)域的核苷酸序列。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應用上述寡核苷酸芯片檢測全基因組CpG島位置的方法，包括如下步驟：

(1)抽提待測樣品核酸；

(2)對步驟(1)抽提的DNA進行純化；

(3)標記步驟(2)純化的DNA；