[發明專利]一種檢測人源化抗CD52抗體生物活性的方法

無效

• 申請號: 200610147289.5
• 申請日: 2006-12-14
• 公開（公告）號: CN101201358A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發明（設計）人: 侯盛;王皓;寇庚;李博華;郭亞軍
• 申請（專利權）人: 上海國健生物技術研究院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/554
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，涉及到一種檢測抗體生物活性的方法。

背景技術：

CD52又稱CAMPATH-1抗原，該抗原表達于正常及惡性的B和T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞表面及男性的生殖系統組織，是一種存在于B淋巴細胞和T淋巴細胞表面的抗原。針對CD52抗原的單克隆抗體在體內可以暫時清除血液內的淋巴細胞，使免疫系統處于失效狀態，使器官移植入患者體內，不會遭到患者免疫系統的排斥，抗CD52單克隆抗體在體內還能夠導致抗體依賴性溶解細胞或殺細胞作用，從而清除血液、骨髓和其他受影響細胞中的惡性淋巴細胞。抗CD52單克隆抗體(CAMPATH-1系列)已經被廣泛地用于臨床治療，此抗體為人源化抗CD52抗體，于2001年5月7日獲得美國FDA批準上市，適應癥為“烷化劑及氟達拉賓治療無效的慢性B淋巴細胞性白血病”。

人源化抗CD52抗體為IgG1亞型，具有人類抗體可變區的框架區、恒定區，以及來源于大鼠單克隆抗體(Campath-1G)的互補決定區。人源化抗CD52抗體的分子量約為150kD。

對于抗體生物活性的檢測方法通常有兩類，一為基于結合某種類型的抗原(對于CD52抗體，為CD52抗原)上，而后再檢測所結合的抗體的方法(ELISA，ADCC，CDC)，另一為已知濃度的標記抗體競爭結合(對于CD52抗體，為利用CD52表達的外周血單個核細胞或細胞系)的方法。

上述方法存在著許多諸如：利用合成的CD52抗原，合成的抗原與天然抗原相比親和力較低，因此檢測方法的靈敏度較差；利用天然的CD52抗原，來源困難(人類脾臟)，不同來源的抗原有很大的差異，純化的抗原有聚集的趨勢；利用抗CD52獨特型抗體代替CD52抗原，檢測的靈敏度低，或與血清Ig有不可避免的交叉反應；利用新鮮外周血單個核細胞，不同供者間CD52表達的差異，病毒污染，難以獲得均一的足夠量的一大批；其他膜抗原的差異導致的非特異結合；利用CD52陽性的細胞系，Fc受體導致的假陽性，檢測靈敏度較差；ADCC或CDC方法，同位素的使用使可操作性下降，檢測的靈敏度及精密度較差等問題。

發明內容：

為了得到長期傳代穩定、密度均一的而且細胞膜表面穩定表達CD52抗原細胞的CD52陽性細胞，本發明的申請人進行了大量實驗，得到了符合此要求的CD52陽性細胞CHO-C，并建立了利用此細胞對人源化抗CD52抗體生物活性進行檢測的方法。

本發明的目的之一是公開一種檢測人源化抗CD52抗體生物活性的方法，包括對樣品及已知活性的參比品進行稀釋、利用CD52陽性細胞進行競爭結合試驗、流式細胞儀檢測和結果計算幾個步驟，其中競爭結合試驗步驟中所用的CD52陽性細胞為CHO-C細胞。

上述檢測方法的主要原理為轉染CD52的CHO-C細胞，其細胞膜表面表達CD52，抗CD52抗體可與CD52特異結合。單純研究熒光標記抗體與細胞的結合的情況，量效曲線應為“S”形，即隨著標記抗體濃度的增加，熒光強度也逐漸增加，直至達到飽和；此時的IC₅₀可代表該抗體與CD52的結合活性，在靶細胞相同的情況下，IC₅₀值越小，抗體與CD52的結合能力就越強，即抗體的活性越好。若存在未標記抗體對標記抗體的競爭，在熒光標記抗體濃度固定(結合曲線的亞飽和點)的條件下，隨著加入的未標記抗體濃度的增加，細胞結合的熒光標記抗體量逐漸減少，因此量效曲線呈反“S”形或“乙”字形；在靶細胞和標記抗體相同的條件下，IC₅₀值越小，則說明加入的未標記抗體與標記抗體競爭的能力越強，與CD52的結合能力越強，即抗體的活性越好。

本發明的另外一個目的，是公開了上述的CHO-C細胞，通過人CD52?cDNA的獲取、表達載體構建、轉染CHO細胞及篩選獲得；其中人CD52?cDNA的獲取和表達載體構建過程包括引物序列的設計、人CD52特異片段的獲得及將該片段裝入表達載體。

本發明進一步公開了得到上述的CHO-C細胞需要的引物序列：

有義引物：5’-CCACCATGAAGCGCTTCCTCTTCCTC-3’(SEQ?ID?NO.1)

反義引物：5’-CTCAACTGAAGCAGAAGAGGTG-3’(SEQ?ID?NO.2)

該對引物在互補區兩側分別加入了酶切位點用于裝入表達載體。

本發明還公開了CHO-C細胞的表達載體，可以為pcDNA3.1、pcDNA4、pCEP4、pREP4之一，優選pcDNA3.1。