[發明專利]一種分離純化嗜鐵鉤端螺旋菌的方法

無效

• 申請號: 200610136739.0
• 申請日: 2006-11-24
• 公開（公告）號: CN101191121A
• 公開（公告）日: 2008-06-04
• 發明（設計）人: 柳建設;謝學輝;王秀美;肖升木;田卓力
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 中南大學專利中心
• 代理人: 胡燕瑜

技術領域

本發明涉及一種微生物培養方法，特別是一種嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum?ferriphilium)純培養物的分離方法。

背景技術

嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum?ferriphilium)是一類專性化能自養鐵氧化細菌，革蘭氏陰性，最適生長pH2.5，最適生長溫度40℃，能夠直接氧化硫化礦物，在微生物浸礦過程中具有重要作用。該菌種不易于純培養，在普通瓊脂固體培養基平板上很難形成菌落，目前它的分離純化主要是采用瓊脂糖雙層平板培養基方法，D.B.Johnson及劉纓，劉相梅，田克立在《微生物學通報》，2003，30(6)，“氧化亞鐵鉤端螺旋菌在固體平板上的培養及形態觀察”中所記載的方法.他們利用瓊脂糖作固化劑，在底層平板中加入嗜酸性異養細菌(Heterotroph?Acidiphilium?SJH)消耗上層無磷培養基中瓊脂糖的一些寡糖類物質而促進嗜鐵鉤端螺旋菌菌落的形成。該方法顯示，菌落形成時間較短，得率較高，但是，該方法使用雙層平板，步驟較單層平板要復雜，使用瓊脂糖作凝膠劑其價格比瓊脂高出約10倍，另外需要嗜酸性異養細菌(Heterotroph?Acidiphilium?SJH)作為輔助細菌，增加了分離工作的額外工作量以及引進了新的影響因素。

發明內容

本發明提供了一種用單層平板分離方法得到純的嗜鐵鉤端螺旋菌的方法，采用改良的固體培養基成分以及優化的培養條件實現分離，它較雙層平板分離方法簡便很多，用普通瓊脂作凝膠劑降低費用，且不需要添加任何其它細菌輔助分離，能大大地減少工作量，并且菌落形成率較高，形成菌落時間在兩周左右。

本發明將采集的酸性礦坑水樣品用9K無機鹽液培養基富集培養一代，然后將其傳代用一種新的選擇性液體培養基A-M培養，選擇性液體培養基A-M成分為：(NH₄)₂SO₄?3g/L，KCl?0.1g/L，K₂HPO₄?0.5g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5g/L，Ca(NO₃)0.01g/L，MnSO₄?1.0g/L，Al₂(SO₄)₃·18H₂O?2.1g/L，FeSO₄·7H₂O44.5-60.0g/L.設定培養基pH值為1.5-1.7，并設定其培養溫度為38-42℃，傳代培養3～4次且每次稀釋5-10倍傳代，最后將處于對數生長期培養物取適量稀釋20-100倍，取其中100μL在改良的單層固體培養基上均勻涂布。改良的單層固體培養基配方由A，B和C三部分組成：A成分同于上述選擇性液體培養基A-M成分：(NH₄)₂SO₄?3g/L，KCl?0.1g/L，K₂HPO₄?0.5g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5g/L，Ca(NO₃)0.01g/L，MnSO₄?1.0g/L，Al₂(SO₄)₃·18H₂O?2.1g/L，溶于400mL蒸餾水；B：普通瓊脂10-15g溶于300mL蒸餾水；C：FeSO₄·7H₂O?44.5-60.0g/L，KSCN?15.5-25.0g/L溶于300mL蒸餾水。將A和B部分分開高壓蒸汽滅菌116-121℃，20-30mins，最后將A，B和C三部分混合，調pH值2.0-3.5，倒平板，在平板上均勻涂布菌液。涂有菌液的固體培養基平板先正置5～10分鐘，待菌液吸收后倒置于36-45℃恒溫培養箱培養。固體培養基顏色為紅褐色，兩周左右長出十多個大小不一的黃色光滑菌落，大的菌落直徑可達3mm左右。

本發明只要用單層平板就能分離得到純的嗜鐵鉤端螺旋菌，采用普通瓊脂作凝膠劑，不需要添加任何其它細菌輔助分離，菌落形成率較高，較雙層平板方法更簡單易行。

具體實施方式：