[發(fā)明專利]一種蒜氨酸酶的一步分離純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610128291.8
• 申請日: 2006-11-28
• 公開（公告）號: CN101191126A
• 公開（公告）日: 2008-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李瑜;許時嬰;吳坤
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00
• 代理公司: 鄭州中原專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張紹琳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于新鮮大蒜中所含成分的分離純化方法，尤其涉及新鮮大蒜中的蒜氨酸酶的分離純化方法。

背景技術(shù)

1948年Arthur?Stoll和Ewald?Seebeck發(fā)現(xiàn)大蒜中存在一種酶，并把它命名為蒜氨酸酶。之后對蒜氨酸酶的研究一直沒有中斷，后來研究發(fā)現(xiàn)蒜氨酸酶(EC.4·4·1·4)是存在于大蒜中的一種內(nèi)源酶，全稱為S-烷基-L-半胱氨酸亞砜酶，其是一種均一的二聚體糖蛋白，大約占蒜中可溶性蛋白質(zhì)的10-12％。完整無損的大蒜中，蒜氨酸酶和它的天然底物S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜(蒜氨酸)等存在于大蒜的不同部位，蒜氨酸酶存在于液泡組織中，而底物則存在于細(xì)胞質(zhì)中，只有當(dāng)大蒜破損，兩者才能相互接觸，蒜氨酸酶通過氨酰基中間體與其輔助因子5’-磷酸吡哆醛結(jié)合在一起，經(jīng)受β-消除-去氨基作用裂解底物成硫代亞磺酸酯。硫代亞磺酸酯類(R-S-S(O)-R)決定了大蒜的絕大部分特性，是大蒜特有的風(fēng)味物質(zhì)，是大蒜產(chǎn)生的各種含硫化合物的前體物質(zhì)，也是大蒜具有許多生物活性功能的原因。故在大蒜加工過程中，蒜氨酸酶對于能否生產(chǎn)出硫代亞磺酸酯保留率較高的優(yōu)質(zhì)干燥大蒜制品至關(guān)重要，所以對大蒜中蒜氨酸酶進行分離純化，以便對其性質(zhì)進行研究，將具有非常重要的理論意義和實踐意義。但直到80年代后才將此酶純化為均一的酶，且純化步驟較為煩瑣。一般要對蒜氨酸酶粗酶液采用親和層析的方法進行初步純化，后采用Supherdex200凝膠柱層析才能得到純度很高的蒜氨酸酶(如KuettnerBartholomeus?E.的制備方法)。有人采用Sephadex?G-200柱層析分離純化了蒜氨酸酶，但此方法僅限于實驗室分析，不能用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。Rabinkov曾采用克隆技術(shù)將蒜氨酸酶克隆出來，這種方法較復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種操作較簡單的蒜氨酸酶的一步分離純化方法，并且使分離純化制得的蒜氨酸酶可達(dá)到電泳純；而且這種方法可以使用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：這種蒜氨酸酶的一步分離純化方法是，在溫度為0-4℃的條件下，按以下步驟完成：

a、均漿：把新鮮的大蒜粉碎，按每千克新鮮大蒜加入800-1200mL?pH6-8

的緩沖液的量計算，在粉碎后的新鮮大蒜內(nèi)加入緩沖液，同時進行攪拌使它們混合均勻；

b、提取上清液：將經(jīng)步驟a所得物質(zhì)進行冷凍離心處理，而后提取上清液；

c、鹽析：在步驟b中提取的上清液內(nèi)加入飽和硫酸胺溶液，加入同時進行攪拌；

d、溶解：把經(jīng)過鹽析后得到的上清液做冷凍離心處理，而后去掉上清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶于pH7的緩沖液內(nèi)；

e、超濾：把溶解后的濾餅用截留分子量為1萬-5萬的濾膜過濾，得到截留物，即為新鮮大蒜的蒜氨酸粗液；

f、分離純化：把制得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl?S-200凝膠柱進行分離：并用pH6-8的緩沖液以10-60mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，收集洗脫液組分；再把它透析得到純化的蒜氨酸酶。

在步驟a中所加入的緩沖液為磷酸緩沖液，它由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、甘油、NaCl、EDTA，和磷酸吡哆醛配制而成；在粉碎后的新鮮大蒜中加入緩沖液時，攪拌速度為每分鐘5000-10000轉(zhuǎn)；

在步驟b中，均漿后的物質(zhì)冷凍離心3-57分鐘；

在步驟d中，把經(jīng)過鹽析后的物質(zhì)，做冷凍離心的時間為10-50分鐘；濾餅重新溶入的緩沖液為磷酸緩沖液，它由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、蔗糖、NaCl和磷酸吡哆醛制成；

在步驟e中，應(yīng)將溶解后的濾餅先做冷凍離心處理，而后再進行超濾，超濾是在壓力為0.25MPa的情況下操作的；

在步驟f中，緩沖液由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、、磷酸吡哆醛制成。

在步驟a中所加入的磷酸緩沖液，其配制比例為：1000mL磷酸緩沖液由50-80mM的NaH₂PO₄、50-80mM的Na₂HPO₄、8-12％v/v的甘油、4-6％w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、4-6μM的磷酸吡哆醛配制而成；