[發明專利]一種蒜氨酸酶的一步分離純化方法

無效

• 申請號: 200610128291.8
• 申請日: 2006-11-28
• 公開（公告）號: CN101191126A
• 公開（公告）日: 2008-06-04
• 發明（設計）人: 李瑜;許時嬰;吳坤
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司
• 代理人: 張紹琳

1.一種蒜氨酸酶的一步分離純化方法，其特征是，在溫度為0-4℃的條件下，按以下步驟完成：

a、均漿：把新鮮的大蒜粉碎，按每千克新鮮大蒜加入800-1200mL?pH6-8的緩沖液的量計算，在粉碎后的新鮮大蒜內加入緩沖液，同時進行攪拌使它們混合均勻；

b、提取上清液：將經步驟a所得物質進行冷凍離心處理，而后提取上清液；

c、鹽析：在步驟b中提取的上清液內加入飽和硫酸胺溶液，加入同時進行攪拌；

d、溶解：把經過鹽析后得到的上清液做冷凍離心處理，而后去掉上清液，留下濾餅，再把濾餅重新溶于pH7的緩沖液內；

e、超濾：把溶解后的濾餅用截留分子量為1萬-5萬的濾膜過濾，得到截留物，即為新鮮大蒜的蒜氨酸粗液；

f、分離純化：把制得的新鮮大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl?S-200凝膠柱進行分離：并用pH6-8的緩沖液以10-60mL/h流速進行梯度洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm進行檢測，收集洗脫液組分；再把它透析得到純化的蒜氨酸酶。

2.根據權利要求1所述的分離純化方法，其特征是，在步驟a中所加入的緩沖液為磷酸緩沖液，它由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、甘油、NaCl、EDTA，和磷酸吡哆醛配制而成；在粉碎后的新鮮大蒜中加入緩沖液時，攪拌速度為每分鐘5000-10000轉；

在步驟b中，均漿后的物質冷凍離心3-57分鐘；

在步驟d中，把經過鹽析后的物質，做冷凍離心的時間為10-50分鐘；濾餅重新溶入的緩沖液為磷酸緩沖液，它由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、蔗糖、NaCl和磷酸吡哆醛制成；

在步驟e中，應將溶解后的濾餅先做冷凍離心處理，而后再進行超濾，超濾是在壓力為0.25MPa的情況下操作的；

在步驟f中，緩沖液由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、、磷酸吡哆醛制成。

3.根據權利要求2所述的分離純化方法，其特征是，在步驟a中所加入的磷酸緩沖液，其配制比例為：1000mL磷酸緩沖液由50-80mM的NaH₂PO₄、50-80mM的Na₂HPO₄、8-12％v/v的甘油、4-6％w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、4-6μM的磷酸吡哆醛配制而成；

在步驟c中，所加入飽和硫酸胺溶液為30-60％的飽和硫酸胺溶液；

在步驟d中，濾餅重新溶入的磷酸緩沖液其配制比例為：1000mL磷酸緩沖液由55-65mM的NaH₂PO₄和55-65mM的Na₂HPO₄、8-12％v/v的蔗糖，1-5％w/v的NaCl、1-10μM的磷酸吡哆醛配制而成；

在步驟f中所采用的緩沖液其配制比例為：1000mL的緩沖液由50-80mM的NaH₂PO₄、50-80mM的Na₂HPO₄、1-5％w/v的NaCl、10-40μM的磷酸吡哆醛配制而成。