[發明專利]抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 200610119308.3
• 申請日: 2006-12-07
• 公開（公告）號: CN101195844A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發明（設計）人: 張欣欣;孔曉飛
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所
• 代理人: 翟羽

技術領域

本發明涉及一種試劑盒，具體地說本發明關于一種抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒及檢測方法。

背景技術

α-干擾素(IFN-α)是目前國際公認的治療慢性乙型肝炎的有效藥物之一，慢乙肝患者IFN-α治療6-12個月后，ALT復常率為34％至45％，HBeAg消失/抗HBe出現率約為15％至37％，HBV-DNA轉陰率(低于105拷貝/ml)為37％，HBsAg轉陰率約為1％-8％。導致慢乙肝患者在干擾素治療之后取得持續性應答、部分應答或者無應答的原因是臨床醫生非常關心的問題，與干擾素應答密切的因素包括治療前高ALT的水平、治療前低HBV-DNA的載量和肝臟組織學明顯的炎癥活動。其他與干擾素應答相關的因素還包括感染后病程短、有急性肝炎過程、女性、無HCV/HIV/HDV合并感染、HBeAg陽性。另外，成年后感染HBV者其干擾素的療效明顯高于母嬰傳播的HBV患者。眾多的研究表明在亞洲流行的B型患者干擾素療效優于C型，而A型療效優于D型，前C區1896位變異與干擾素療效密切相關。干擾素治療早期病毒學應答HBeAg、HBV-DNA下降以及肝臟內cccDNA的含量、HBcAg含量對預測干擾素療效具有重要的意義。

MxA表達在慢乙肝中具有重要的臨床意義。Leifeld?L等發現在暴發型肝衰竭患者肝臟MxA的表達明顯高于慢乙肝患者，Fernandez?M等研究發現IFN-α刺激后MxA應答在慢乙肝患者中明顯低于健康對照，而且HBV-DNA滴度高的患者MxA的應答更弱。King?JK等收集慢乙肝干擾素治療有應答者46名和無應答者36名，對干擾素信號傳導途徑中的22個單個核苷酸多態性進行分析，發現MxA-88為G/T雜合子在干擾素應答組中占43％，而無應答組為19％，雜合子率在有應答組高于無應答組。目前上?；瞪锛夹g有限公司其網站和銷售人員提供乙型肝炎干擾素療效預測的檢測，其理論根據來源于60例丙型肝炎患者300多個干擾素誘導基因SNP分析的結果，選擇主要的5個基因的19個SNP進行基因分型，并對其方法做出有效的患者進行干擾素治療，在這部分患者干擾素的有效率是60％，明顯高于臨床所觀測到的干擾素療效，但目前為止未見公開發表或國內外專利。

目前對干擾素療效的預測判斷主要來自于臨床醫生對患者各方面臨床指標的考慮，如性別、年齡、ALT、HBV-DNA、HBeAg等，但是這些判斷缺乏準確性、客觀性、不能提高受治療患者的有效率。上海基康公司推出的SNP預測干擾素療效由于缺乏公開文獻，也無法進行客觀的評價。但是利用SNP進行療效預測普遍存在的問題是人群的復雜性以及其SNP分布只有三種基因型，而分布頻率可能影響其在人群整體中的價值，如MxA-88G/T?SNP與干擾素療效相關，但是其傾向于有效的T等位基因在中國人群中的頻率只有10％，這樣排除了大部分可能有效的患者進行治療的可能。

發明內容

本發明的目的在于：

(1)提供一種抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒；

(2)提供一種利用抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒檢測方法。

本發明的目的是通過以下技術方法來實現的：

一種抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒，包括：MxA和管家基因GAPDH擴增引物，dNTP，用于PCR反應的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種。

其中，MxA：正向引物：-2040F：5’GTCCAGCTCGGCAACAGACT3’，(見SEQ1)，反向引物：-2157R：5’CATGAAGAACTGGATGATCAAAGG3’(見SEQ2)，探針：-2093T：5’FAM-CCTATCACCAGGAGGCCAGCAAGCG3’TARMA；(見SEQ3)，GAPDH：正向引物：-81F：5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3’，(見SEQ4)，反向引物：-287R：5’GAAGATG?GTGATGGGATTTC3’，(見SEQ5)探針：-258T：5’FAM-CAAGCTTCCCGTTC?TCAGCC3’TARMA(見SEQ6)；其中抗病毒基因MxA序列(見SEQ7)；

所述的PCR緩沖液中含有1X?Buffer，2mM?MgCl₂，200μM?dNTP，1UTaq酶，正反向引物均500nM，探針為200nM。

一種利用抗病毒基因MxA熒光定量試劑盒檢測方法，包括以下步驟：

(1)、采集外周血單個核細胞PBMC；

(2)、干擾素刺激PBMC細胞；