[發明專利]一種雙功能融合蛋白及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200610117831.2
• 申請日: 2006-11-01
• 公開（公告）號: CN101173008A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 熊思東;儲以微;楊秀利;王纓
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K38/16;C12N15/09;A61P35/00
• 代理公司: 上海世貿專利代理有限責任公司
• 代理人: 嚴新德

技術領域

本發明涉及生物工程技術，尤其涉及結構融合蛋白，特別是一種雙功能融合蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

研究表明，ITAC是CXCR3功能最強的激動劑，ITAC與CXCR3受體親和力高，具有顯著的趨化活性、能迅速誘導受體內化及觸發細胞鈣離子內流。與IP-10相比，ITAC動員細胞內鈣離子的能力是IP-10的兩倍。趨化因子受體被激活后會抑制它自身的反應活性，表現為受體脫敏和受體內化兩種形式，這是淋巴細胞保持對微小趨化成分改變發生反應的關鍵機制。研究表明，IP-10及ITAC與CXCR3陽性細胞共孵育，受體內化在15分鐘時最顯著，并以ITAC誘導內化最明顯，CXCR3在細胞表面消失率依次為ITAC75-85％、IP-10?35-40％。對于活化T細胞，ITAC及IP-10的半數有效濃度(EC50)分別是6nM，20nM。以上研究顯示，對受體的活化能力ITAC較IP-10顯著，而受體CXCR3活化必然會影響細胞的生物學功能。由于趨化因子激活受體的部分位于無固定結構的N端，該區域突變將顯著降低趨化因子的活化并影響結合能力。

已有研究也表明，趨化因子C端與其抗血管生成作用相關。目前尚無研究顯示IP-10和ITAC抗血管效應的強弱。IP-10及ITAC通過C端固定在血管內皮細胞表面，是其發揮抗血管生成作用的關鍵。Soejima等報道，IP-10能與血管內皮細胞表面的特異性受體結合，但是ITAC不能競爭結合IP-10在血管內皮細胞上的受體。可能提示IP-10與血管內皮細胞結合能力較ITAC強，從而發揮更明顯的抗血管生成效應。以往研究證實，較低濃度的IP-10即能顯著抑制IL-8誘導的血管內皮遷移，而ITAC需要的有效濃度較高。我們的實驗結果同樣顯示，IP-10具有顯著抑制bFGF誘導的血管內皮細胞遷移及其誘導的微血管形成等作用。隨IP-10濃度增加血管內皮細胞增殖顯著抑制，ITAC抑制血管增殖的作用沒有IP-10顯著。這些研究結果表明IP-10具有較強的抗血管生成作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種雙功能融合蛋白，所述的雙功能融合蛋白解決了現有技術中的單個趨化因子空間構像不穩定性的技術問題。

本發明的這種雙功能融合蛋白包括有兩個功能結構域，其中的一個功能結構域由模擬小鼠趨化因子ITAC的N端及N-LOOP區組成，其中的另一個功能結構域由小鼠IP-10的C端組成兩個功能結構域通過限制性酶切位點進行連接。

進一步的，所述的模擬小鼠趨化因子ITAC的N端及N-LOOP區具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，小鼠IP-10的C端具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。

進一步的，所述的兩個功能結構域通過限制性酶切位點HindIII進行連接。

本發明還提供了一種DNA分子，該DNA分子編碼上述雙功能融合蛋白。

進一步的，所述的DNA分子，具有SEQ?ID?NO：5所示的堿基序列。

本發明還提供了一種載體，所述的載體中含有上述所述的DNA分子。

本發明還提供了一種細胞，含有上述所述的載體。

本發明還提供了一種藥物組合物，含有有效量的所述的雙功能融合蛋白和藥學上可接受的載體。

本發明還提供了一種制備所述的雙功能融合蛋白的方法，該方法包含以下步驟：

1)合成ITAC的N端及N-LOOP區編碼基因，所述的ITAC的N端及N-LOOP區編碼基因含有SEQ?ID?NO：3所示的堿基序列；

2)合成IP-10的C端編碼基因，所述的IP-10的C端編碼基因含有SEQ?ID?NO：4所示的堿基序列；

3)將兩個基因編碼片段通過限制性內切酶切出粘性末端，通過連接酶連接產物作為模板，再用ITAC的N端上游引物及IP-10的C端下游引物，PCR方法大量擴增雙功能分子的全長編碼基因，將雙功能分子的編碼基因克隆入質粒，構建含有雙功能全長編碼基因的質粒；

4)將3)步驟中獲得的含有雙功能全長編碼基因轉染細胞，經篩選獲得穩定轉染含有雙功能全長編碼基因的細胞株，通過細胞株的表達，獲得所述的雙功能融合蛋白。

進一步的，所述的質粒為pcDNA3質粒。

進一步的，所述的連接酶為T₄DNA。

進一步的，所述的細胞為4T1細胞。

本發明還提供了所述的雙功能融合蛋白在制備治療腫瘤藥物中的應用。