[發明專利]KILLER多肽在制備治療腫瘤藥劑中的應用

無效

• 申請號: 200610116054.X
• 申請日: 2006-09-14
• 公開（公告）號: CN101143209A
• 公開（公告）日: 2008-03-19
• 發明（設計）人: 王樹林;任大明;符薇;朱向瑩
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 姚靜芳

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及KILLER多肽在制備治療腫瘤藥劑中的應用。

背景技術

腫瘤疾病現已上升為世界第2號″殺手″，其死亡人數僅次于心血管病。幾年來，國內外醫學界對于腫瘤疾病的發病機理在細胞基礎上又有了新的認識?；趯δ[瘤發病機制的進一步理解，人們利用各種途徑來研制和開發能夠特異，有效地殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無毒性的藥物。目前，對于癌癥的治療仍以化療及放療為首選，兩者雖對腫瘤的治療取得了相當的療效，但由于缺乏對腫瘤細胞的特異性因而具有較大的毒副作用以及某些腫瘤細胞對化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了它們在臨床中的應用。近年來，為了開發出能特異性地殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無毒負作用的藥物，人們對癌癥的發病機制從細胞，分子水平上的研究予以高度重視和巨額投資。

抑癌基因KILLER的編碼產物是細胞表面的TRAIL受體同時它又是轉錄調控因子p53的下游靶基因，可通過誘導細胞凋亡而抑制腫瘤細胞在體外，體內的生長，因而被認為是一個腫瘤基因治療的新點。

減毒鼠傷寒沙門氏菌被證實它不僅可以特異地在腫瘤細胞中高度集聚增殖并抑制腫瘤細胞在小鼠體內的生長，同時也可作為工程菌運輸載體來表達外源基因且具有良好的腫瘤細胞靶向性，因而，減毒傷寒沙門氏菌介導的腫瘤基因治療將會為癌癥的治療開辟一條新的途徑。

發明內容

本發明的目的是提供KILLER多肽在制備治療腫瘤藥劑中的應用，包括介導的腫瘤靶向基因治療技術。

本發明提供了KILLER多肽在制備治療腫瘤藥劑中的應用，所述的治療腫瘤藥劑為腫瘤靶向基因治療藥物。主要是基于減毒鼠傷寒沙門氏菌可以特異地在腫瘤細胞中高度集聚增殖并可作為工程菌運輸載體來表達KILLER基因，所以通過口服給藥后，減毒鼠傷寒沙門氏菌可由腸道通過不同途徑到達腫瘤部位進而持續表達KILLER，從而提高藥物的腫瘤靶向性和效率。

本發明中，KILLER基因開放閱讀框序列是從人腎cDNA表達文庫篩選得到，cDNA序列的長度為1323bp，利用基因工程技術表達該蛋白，相應的多肽分子量為55KD。

在本發明中，術語“KILLER基因開放閱讀框序列”包括KILLER基因或者其簡并序列的開放閱讀框序列(其全長核苷酸序列見NCBINM003842)。該簡并序列是指，KILLER基因序列(開放閱讀框)中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與KILLER基因序列的ORF核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出KILLER蛋白的序列。該術語還包括其表達產物具有抗腫瘤活性并且其序列具有如KILLER基因序列的核苷酸分子的變異形式。這些變異形式不影響其表達產物的抗腫瘤活性，包括(但并不限于)：若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。

本發明的KILLER具有可以有效地誘導腫瘤細胞凋亡的作用。

本發明中，將KILLER克隆入真核載體中然后轉染人結腸癌(HCT116)細胞，48小時后收集細胞，流式細胞儀檢測結果提示KILLER過度表達可以較好的誘導細胞凋亡(圖1)。

本發明中，用Western?blot和PCR的方法來檢測減毒鼠傷寒沙門氏菌介導的KILLER在腫瘤細胞中的表達，結果提示與空白對照菌株比較，KILLER可在腫瘤細胞中表達，其蛋白產物為55KD。表達KILLER的減毒鼠傷寒沙門氏菌感染人腫瘤細胞后，可誘導明顯的腫瘤細胞凋亡；隨著感染時間的增加，更多的腫瘤細胞發生凋亡。本發明的表達KILLER的減毒鼠傷寒沙門氏菌可以用于誘導人結腸癌細胞、人胰腺癌細胞、肝癌細胞、人宮頸癌細胞、人非小細胞肺癌細胞、骨肉瘤細胞、人急性T淋巴細胞性白血病細胞和人急性早幼粒白血病細胞等腫瘤細胞的凋亡

表達KILLER的減毒鼠傷寒沙門氏菌可以抑制腫瘤細胞在小鼠體內的生長：用表達KILLER的減毒鼠傷寒沙門氏菌經口服喂食荷瘤小鼠，與空白對照菌株比較，可以明顯地抑制腫瘤細胞在小鼠體內的生長并延長荷瘤小鼠的生長周期。