[發明專利]弓形蟲免疫金標快速檢測試劑及制備方法

無效

• 申請號: 200610104848.4
• 申請日: 2006-10-29
• 公開（公告）號: CN101169413A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 張德林;王艷華;李學瑞;才學鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/544
• 分類號: G01N33/544;G01N33/532
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心
• 代理人: 鮮林

技術領域

本發明涉及一種檢測抗體的免疫膠體金試劑及該試劑的制備方法。

背景技術

現有檢測弓形蟲抗體的方法主要有酶聯免疫吸附和間接血凝法，這兩種方法都有缺陷和不足。酶聯免疫吸附法的缺點是：需要專門的儀器設備如酶標儀來配合使用；試劑需要低溫保存；檢測操作人員需要經過專業培訓；操作過程相對復雜，檢測所需時間比較長；檢測所需費用較高，不能實現單人(頭、只)份檢測；不利于在基層單位進行推廣使用。間接血凝法除上述缺點外還存在的缺陷是靈敏度低，容易出現漏檢的情況。中國發明專利申請CN1431513A和CN1431514A分別公開了一種“檢測弓形蟲抗體IgM免疫膠體金試劑及制備方法”和一種“檢測弓形蟲抗體IgG免疫膠體金試劑及制備方法”，它們都存在以下的不足：(1)弓形蟲特異性表面膜抗原和單克隆抗體的制備工藝繁瑣；(2)試劑檢測范圍受到限制，只能檢測人的弓形蟲病；(3)該試劑不能同時檢測抗弓形蟲IgG和IgM。

發明內容

本發明的目的是為了克服當前技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種不需要特定儀器設備輔助的檢測試劑，同時可檢測人和各種動物的弓形蟲抗體IgG及IgM，并且能有效地降低檢測成本，減輕檢測人員的負擔。本發明同時提供該試劑的制備方法。

本發明采取以下技術方案解決其所要解決的技術問題：

檢測抗弓形蟲抗體免疫金標快速檢測試劑包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，其特征在于結合墊包被了帶有弓形蟲代謝分泌抗原的膠體金結合物，硝酸纖維素膜上以線形包被了弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體。

該試劑的制備方法如下：(1)制備弓形蟲代謝分泌抗原：20～25克體重小鼠每只按1×10⁵～1×10⁶弓形蟲速殖子腹腔接種，經3～4日，小鼠出現精神沉郁、不食、被毛粗亂等癥狀時，脫頸致死小白鼠，浸泡于70～75％酒精內體表消毒；每只小鼠用2～3毫升PH7.2?0.15mol/L?PBS緩沖液洗腹收集蟲體；將所收集的腹腔液以3000～4000rpm離心30～40分，收集上清液；將上清液在-15℃～-70℃放置24～48小時，凍融化開后再次以3000～4000rpm離心30～40分鐘，離心2～3次，收集上清液；上清液即為弓形蟲代謝分泌抗原。(2)制備抗弓形蟲抗體：用弓形蟲抗原免疫羊，瓊擴檢測達1∶32～64時采集免疫羊血清，用飽和硫酸法粗提取羊抗弓形蟲抗體，再用凝膠層析法純化羊抗弓形蟲抗體；(3)制備膠體金：用檸檬酸三鈉將氯金酸還原成40～60納米的膠體金顆粒；(4)制備弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物：將膠體金與弓形蟲代謝分泌抗原按1∶0.02(ml/mg)比例攪拌混勻，使之形成穩定的復合物，通過純化濃縮形成弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物；(5)將弓形蟲代謝分泌抗原膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將弓形蟲代謝分泌抗原和抗弓形蟲抗體以線形包被在硝酸纖維膜的檢測區和滯控區，充分干燥。

檢測時，從鋁箔袋中取出檢測試劑條(板)，按MARK線下箭頭所示的方向將試劑條浸入樣本溶液中，液面不得超過MARK線，15～20秒后取出，平放在操作臺上；如果是試劑板：從鋁箔袋中取出檢測試劑板，平放在操作臺上，往加樣孔中滴加三滴(約100μl)樣品溶液(血清)；3～15分鐘內即可判斷結果，30分鐘后判斷的結果無效。

判斷標準：檢測區、質控區均出現紅色條帶者為陽性結果；檢測區無條帶、質控區出現紅色條帶者為陰性結果；檢測區、質控區均未出現紅色條帶出現，則產品為無效。

本發明的積極效果在于：(1)應用范圍廣，可檢測人和各種動物的弓形蟲抗體；(2)快捷迅速，全過程只需30分鐘；(3)靈敏準確，敏感性和準確性高于間接血凝試劑，與ELISA試劑結果相同，結果受外因影響較小，可在養殖場現場進行檢測；(4)操作簡單，不需要任何特殊儀器和設備，檢測人員無需專業培訓，適合在基層推廣應用；(5)價格低廉，價格是ELISA試劑的三分之二；(6)保存和運輸方便，一般保存于4℃冰箱即可；(7)安全穩定，膠體金、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯均無毒性，絕對不會造成環境污染。

表1弓形蟲金標試紙條特異性試驗