[發明專利]利用金磁微粒進行細胞分選的方法

有效

• 申請號: 200610104760.2
• 申請日: 2006-10-19
• 公開（公告）號: CN101165173A
• 公開（公告）日: 2008-04-23
• 發明（設計）人: 崔亞麗;陳超;劉蓓;高婧
• 申請（專利權）人: 陜西西大北美基因股份有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司
• 代理人: 商宇科

技術領域

本發明涉及一種利用金磁微粒從含不同細胞的混合樣本中分離所需目的細胞的方法。

背景技術

隨著生命科學的不斷發展，細胞生物學和免疫學基礎研究以及臨床疾病的診斷與治療都需要從含有不同細胞的混合樣本中分離出純化細胞，現有的細胞分離技術主要有：Ficoll密度梯度離心，離心洗提，雙水相分離，這些方法都是利用細胞大小，密度，表面電荷等物理性質的特征加以分離，難以獲得理想純度及回收率，而流式細胞儀分選雖然能獲得很高的純度和回收率卻需要昂貴儀器，且操作過程復雜費時，CN1376779公開了一種染色后介電電泳從母體血液樣本中分離胎兒細胞和分離紅細胞和白細胞的方法，該方法不但需要較復雜儀器，而且不具備分離其他細胞樣本的通用性。ZL00256373.8公布開了一種免疫親和分離柱，將親和素交聯的凝膠充填在親和層析柱中，用生物素化單抗和細胞懸液通過層析柱，此方法成本較高；CN1357620公開了一種利用不同種類細胞吸附性質的不同分離造血干細胞，其方法同樣不具備通用性。

磁性微粒用于細胞分選是近些年來迅速發展起來的一項細胞分離的技術，其通過在磁性微粒上標記抗體分子使其和細胞發生特異性結合，借助于外磁場的作用，使和磁性顆粒結合的細胞發生定向移動而實現目的細胞的分離，此方法操作簡便迅速，不需要大規模儀器，且能獲較高的純度和回收率。Molday最早將含羧基的磁性高分子微粒用于細胞分離的研究(Application?ofmagnetic?microspheres?in?labeling?and?separation?of?cells[J].Nature，1977，268：437～438)，美國專利4230685公開了利用蛋白A結合的磁粒分離細胞的方法，美國專利6190870公開了磁性微粒從外周血中分離腫瘤細胞的方法，美國專利5635363公了磁性微粒分離純化抗原特異性T細胞的方法。市場上已有用于細胞分選的商品化的磁粒出售如Dynalbiotech公司的粒徑4.5μm的苯乙烯磁粒Milteny公司的50nm的葡聚糖包覆磁粒，BD公司的粒徑200nm的二氧化硅磁粒。但這些用于細胞分選的磁性微粒大都為有機/無機磁性復合顆粒，即以磁性材料為核心，有機小分子，天然高分子，有機合成高分子等為殼層，這些磁粒用于細胞分選仍存在一些缺陷：如表面通過共價修飾固定抗體分子，固定方法復雜且易造成抗體活性損失；單位質量磁性微粒固定抗體分子數量少，細胞分選后續步驟磁粒與細胞的解離復雜且成本較高，價格昂貴。

組裝型磁性復合微粒和核/殼型超順磁性復合微粒的制備方法以及結構組成已經在中國專利ZL?03153486.4和ZL?03124061.5分別進行了公開，但其應用中主要包括分子或細胞標記以及相關檢測的內容，未涉及到細胞分選的內容。

發明內容

本發明為解決背景技術中存在的上述技術問題，而提供一種制作簡單迅速，低成本，對所結合細胞毒性小，不影響細胞活力，能夠用于后續培養的金磁微粒進行細胞分選的方法。

本發明的技術解決方案是：本發明為一種金磁微粒用于細胞分選的方法，其特殊之處在于：該方法包括以下步驟：

1)在金磁微粒表面直接固定或通過其他親核配基間接固定單克隆抗體分子：其可包括以下四種方式：方式一：可以通過直接固定單克隆抗體分子；方式二：可以通過先固定二抗分子再和單抗分子結合間接固定；方式三：可以通過鏈親和素和生物素化的單抗結合間接固定；方式四：可以通過先固定蛋白A或蛋白G再結合單抗分子間接固定。

2)細胞和金磁微粒的結合：將固定好單克隆抗體分子的金磁微粒和待分離樣本孵育15-60min，使細胞表面抗原和單克隆抗體充分結合而將細胞固定在金磁微粒表面；

3)磁分離：孵育完畢之后，使用磁性分離裝置進行磁分離2-5min，將目的細胞和其它細胞分開；

4)清洗：磁分離結束后對金磁微粒進行清洗洗去非特異性結合的細胞，用清洗緩沖液在不撤去外磁場的條件下緩慢沖洗金磁微粒，棄上清，重復此步驟直至洗去非特異性結合的細胞。

以下以1mg金磁微粒說明表面固定單克隆抗體分子的步驟，具體應用時可根據比例放大或縮小相應倍數。

方式一中直接固定單克隆分子的具體步驟如下：

1.1)金磁微粒的預處理：取1mg金磁微粒，置于離心管中，加入200-800μl偶聯緩沖液搖勻，磁性分離1-3min，棄上清；

1.2)抗體溶液的配制：將單克隆抗體溶解于200-800μl偶聯緩沖液中，然后加入到含有預處理過的金磁微粒的離心管中；