[發明專利]無機磷診斷/測定試劑盒及無機磷濃度的測定方法

無效

• 申請號: 200610097314.3
• 申請日: 2006-10-30
• 公開（公告）號: CN101173937A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/84
• 分類號: G01N33/84;G01N21/78;G01N21/25;C12Q1/32;C12Q1/00
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技術領域

本發明涉及一種無機磷診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定無機磷濃度的測定方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。

背景技術

人體內磷的87％都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35——40。當二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，＞70時，可發生轉移性鈣化。當乘積＜35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、[Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁腺激素及降鈣素的調節。

由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析磷酸鹽陰離子(H₂PO₄^1-，HPO₄^2-)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結合法，酶法，同位素稀釋質譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機磷的常規方法是比色法。

磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標本空白，否則結果偏高。

酶法測定無機磷是發展趨勢，其優點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范圍內是穩定的，可用于常規樣品的自動化分析。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶聯法(Couple?Reaction)技術，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的無機磷診斷/測定試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行無機磷濃度的測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明無機磷濃度測定方法原理如下：

無機磷+谷氨酰胺+腺苷二磷酸?谷氨酰胺合成酶氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸

腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳?丙酮酸羧化酶無機磷+腺苷二磷酸+草酰乙酸

氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶?谷氨酸脫氫酶L-谷氨酸+水+輔酶

丙酮酸羧化酶(EC?6.4.1.1)、谷氨酰胺合成酶(EC?6.3.1.2)作為循環酶：谷氨酰胺合成酶的酶促作用利用無機磷和腺苷二磷酸作用產生腺苷三磷酸；丙酮酸羧化酶再將腺苷三磷酸再次變回無機磷及腺苷二磷酸，使無機磷不斷地被重復循環利用，產生大量的氨離子。

谷氨酸脫氫酶(EC?1.4.1.2；EC?1.4.1.3、EC?1.4.1.4)作為顯色酶，利用氨離子使還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算出無機磷濃度。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明無機磷診斷/測定試劑盒較為理想：

緩沖液????????????????100mmol/L

穩定劑????????????????50mmol/L

還原型輔酶????????????0.25mmol/L

丙酮酸羧化酶??????????6000U/L

谷氨酰胺合成酶????????6000U/L

谷氨酸脫氫酶??????????8000U/L

腺苷二磷酸????????????2mmol/L

谷氨酰胺??????????????4mmol/L

2-酮戊二酸酯????????????16mmol/L