[發明專利]攜帶質體轉運肽的紫槐二烯合成酶融合基因及應用

無效

• 申請號: 200610095202.4
• 申請日: 2006-11-14
• 公開（公告）號: CN101074443A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發明（設計）人: 廖志華;陳敏;諶容
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/52;C12N9/00;C12N15/82
• 代理公司: 重慶華科專利事務所
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體地說是用青蒿芳樟醇合成酶的轉運肽lstp和紫槐二烯合成酶基因ads構建lstp-ads融合基因及其在轉基因青蒿中的應用。

背景技術：

近年的統計資料表明：世界有100多個國家和地區的20多億人生活在瘧疾流行區，每年約有2.7億人患這種疾病，其中有近300萬人死于瘧疾。正因為瘧疾的危害如此嚴重，世界衛生組織1957年就開始實施了一項“全球消滅瘧疾計劃”，但至今成效不顯。其原因是從60年代起瘧原蟲對氯喹等主要抗瘧藥產生抗性，使這些藥失去了抗瘧藥效。為此世界上許多國家都投入了大量人力物力去研究開發新的抗瘧藥物。青蒿素類藥及其衍生物是我國科學工作者發掘祖國醫藥學寶庫研究開發的一類抗瘧新藥，具有自主知識產權，目前廣泛應用于瘧疾的治療。全世界每年青蒿素的需求量為150噸左右，而產量僅為15噸左右，明顯供不應求，目前售價已達到約225美元/g。開展青蒿素的研究具有很好的經濟效益和社會效益。

目前提高我國青蒿產品的科技含量，提升青蒿產業地位已勢在必行，這有賴于科技的源頭的創新，現代生物技術在生產優質青蒿素藥源方面可以起到決定性作用。優質藥源的嚴重匱乏是目前青蒿素生產上面臨的最大問題。近幾年來，尋找及擴大天然藥物青蒿素藥源是一個十分活躍的研究領域，取得了很大的進展，主要包括以下三個方面：(1)利用傳統育種技術培育高含量青蒿素的青蒿栽培品種；(2)青蒿素的化學全合成或半合成；(3)利用現代生物技術提高青蒿中青蒿素含量。在這些研究領域中，培育高含量青蒿素的青蒿栽培品種所需周期太長，效率很低，青蒿素的含量不可能得到大幅度提高，此外，從天然青蒿中提取，產量受資源、環境和季節的限制，且生產成本高、產量低、難以滿足市場需求；青蒿素雖已能人工合成，但成本高、難度大，也未能投入生產。

相比之下，利用基因工程技術遺傳改良青蒿，開展青蒿素代謝工程研究，生產青蒿素就具有很大的優勢：(1)在生物技術研究領域中，研究人員對青蒿離體培養和青蒿遺?傳轉化的成功，為利用生物技術生產青蒿素奠定了良好的理論和實踐基礎；(2)利用基因工程技術在基因水平上快速、高效地遺傳改良青蒿，獲得目標藥用成分含量大為提高且具遺傳穩定性的轉基因藥用植物(包括幼苗、毛狀根、細胞系等)已經有不少成功報道，實現了我國在植物次生代謝工程研究領域的重大突破。(3)由于目前已闡明了青蒿素生物合成代謝途徑中的重要步驟并且相關的限速酶基因已經克隆使得實現青蒿素的代謝工程成為可能：青蒿素屬于倍半萜衍生物，青蒿素的生物合成途徑屬于植物類異戊二烯代謝途徑。植物類異戊二烯的生物合成至少存在兩條途徑，即甲羥戊酸途徑和丙酮酸/磷酸甘油醛途徑。此兩條途徑生成的異戊烯基焦磷酸(IPP)和其異構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)在牻牛兒基焦磷酸合酶的催化下，通過親電反應機制形成牻牛兒基焦磷酸(GPP)，進而在法呢基焦磷酸合酶(farnesyl?diphosphate?synthase，FPS)形成法呢基焦磷酸(FDP)。法呢基焦磷酸在倍半萜合酶催化下通過分子內部環化以及各種氧化-還原修飾，最后形成倍半萜類化合物。青蒿中存在一系列的倍半萜合酶(倍半萜合酶基因家族)。青蒿中參與青蒿素生物合成的倍半萜環化酶是紫槐二烯合成酶(amorpha-4，11-diene?synthase，ADS)。該酶催化FDP形成青蒿素生物合成的倍半萜中間產物amorpha-4，11-diene，再進一步轉化為青蒿素。ADS對青蒿素的合成具有重要作用，是青蒿素代謝工程的重要靶點。有的研究者提出青蒿素的合成可能在質體中進行，通過提高質體中青蒿素生物合成途徑上的關鍵酶活性有可能提高青蒿素的含量。

目前國內外青蒿的相關研究大多集中在青蒿素的分離提取工藝、半合成或全合成、藥理作用、組織培養等研究上，而利用轉基因技術把青蒿素生物合成的關鍵酶基因和其他重要相關基因轉入青蒿中高效表達、穩定遺傳，從而獲得青蒿素含量提高的青蒿還未見報道。因而，基因工程技術是提供青蒿素優質藥源的理想和可持續的途徑，有望實現青蒿素的代謝工程，為我國青蒿素產業提供優質的青蒿素藥源，有利于以青蒿素產業為契機，拉動我國中藥產業升位。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種利用基因工程技術遺傳改良青蒿的方法，該方法將攜帶質體轉運肽的紫槐二烯合成酶基因在青蒿質體中高效表達，從而提高青蒿中青蒿素的?合成能力。

在本發明的另一方面，還提供了一種植物表達載體，它包含上述青蒿攜帶質體轉運肽的紫槐二烯合成酶基因核苷酸的編碼區。