[發明專利]與肝癌相關的ESR1基因多態性及其檢測方法

無效

• 申請號: 200610082338.1
• 申請日: 2006-05-24
• 公開（公告）號: CN101078027A
• 公開（公告）日: 2007-11-28
• 發明（設計）人: 賀福初;周鋼橋;翟蕓;張秀梅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1、通過檢測ESR1基因的(TA)_n多態性位點(rs3138774)、T29C(rs2077647)位點和Pvu?II(rs2234693)位點以及由(TA)_n、T29C、Pvu?II和XbaI位點組成的單倍型來判定個體對肝癌是否易感的方法。其特征在于當某一個體的ESR1基因的(TA)_n多態性位點(rs3138774)表現為H等位型、T29C(rs2077647)位點表現為基因型C/C、Pvu?II(rs2234693)位點表現為C/C基因型，或由(TA)_n、T29C、Pvu?II和Xba?I位點組成的單倍型表現為HCCG或LCCA時，則表明該個體對肝癌具有更高的易感性。

2、三種檢測ESR1基因的(TA)_n多態性位點(rs3138774)、T29C(rs2077647)位點和Pvu?II(rs2234693)位點的基因型的方法。分別為片段分析法、PCR-RFLP方法和PCR產物直接測序的方法，其各自的主要特征在于以下關鍵方面：

(1)對于(TA)_n多態性位點：

1)對包含(TA)_n多態性位點(rs3138774)的ESR1基因序列，設計特異性的引物，其序列為：

正向引物：5′-GGCTGCAGCAAAGGAAGTTTA-3′(用FAM熒光標記)；

反向引物：5′-CGATCTTCTCGGTTCACTTGG-3′。

2)對包含(TA)_n多態性位點的ESR1基因區域，以所設計的引物，通過熱啟動和梯度的聚合酶鏈式反應，以基因特異性引物進行DNA擴增。

3)PCR產物在ABI?3730型測序儀上進行測序，并使用Genescan軟件(ABI，USA)進行分析。由內標確定等位型的長度，由等位型的長度大小的組合確定基因型。

(2)對于T29C多態性位點：

1)對包含T29C(rs2077647)多態性位點的ESR1基因序列，設計特異性的引物，其序列為：

正向引物：5’-GACCATGACCCTCCACACCAAAGGATC-3’(標有下劃線的堿基為人為引入的單堿基誤配)；

反向引物：5’-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3’。

2)對包含T29C(rs2077647)多態性位點的ESR1基因區域，以所設計的引物，通過熱啟動和梯度的聚合酶鏈式反應，以基因特異性引物進行DNA擴增。

3)3??1的220bp?PCR產物以4U的BamHI充分酶切，并以3％的瓊脂糖凝膠進行酶切片斷分析，29C/C基因型者具BamHI酶切位點(G↓GATCC)顯示197bp和23bp兩條帶，29T/T基因型者因沒有酶切位點則不能被切開，只有220bp一條帶，而29T/C雜合子顯示上述3條帶。

(3)對于Pvu?II多態性位點：

1)對包含Pvu?II(rs2234693)和XbaI(rs9340799)多態性位點的ESR1基因序列，設計特異性的引物，其序列為：

正向引物：5′-CATGAACCACCATGCTCAGTC-3′；

反向引物：5′-GCAGCAAAAGGTGTTGCCTAT-3′。

2)對包含Pvu?II(rs2234693)和XbaI(rs9340799)多態性位點的ESR1基因區域，以所設計的引物，通過熱啟動和梯度的聚合酶鏈式反應，以基因特異性引物進行DNA擴增。

3)采用96孔Millipore?MultiScreen純化板對PCR產物進行純化。取純化的PCR產物2μl為模板，用ABI?PRISM?Big-Dye測序試劑盒，以PCR反應兩側引物為測序引物分別進行正反向測序反應。測序反應產物經乙醇純化后于ABI?3730自動測序儀進行毛細管電泳和序列測定。同一片斷以正反向引物測序后，得到序列的色譜圖ABI文件。將文件傳送到SGI工作站，用Phred-Phrap-PolyPhred-Consed軟件包進行測序峰圖的多重比對和對多態性位點的檢讀。