[發(fā)明專利]一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610079938.2
• 申請日: 2003-08-20
• 公開（公告）號: CN101144817A
• 公開（公告）日: 2008-03-19
• 發(fā)明（設計）人: 吳文翰;陳泓霖;陳國雄;吳子柏
• 申請（專利權(quán)）人: 香港神農(nóng)有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/53;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司
• 代理人: 劉孟斌

[技術領域]

本發(fā)明涉及對鼻咽癌及其他EB病毒相關疾病進行血清學診斷的試劑盒及其制備方法，特別是采用特定的EB病毒蛋白作為靶抗原檢測血清中抗體水平的試劑盒以及EB病毒重組多肽制備酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的方法。

[背景技術]

在我國，幾乎100％四歲以上的人群均已感染了EB病毒，80％以上的健康成人是EB病毒攜帶者。EB病毒攜帶者血清中可以存在一種或2至3種(不是多種，即不是3種以上)低水平的(不是高水平的)抗EB病毒抗體。我國南方，特別是珠江三角洲及香港地區(qū)，是世界上鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，而鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染密切相關。我國南方及香港地區(qū)也是其他EB病毒相關疾病，例如鼻腔、鼻竇的NK/T細胞淋巴瘤、肺的淋巴上皮瘤樣癌和傳染性單核細胞增多癥等的高發(fā)區(qū)。前兩者患者血清EB病毒抗體譜與鼻咽癌患者的類同，而傳染性單核細胞增多癥患者血清EB病毒抗體的出現(xiàn)有一定的先后規(guī)律性。

目前常規(guī)地在臨床上應用的血清EB病毒抗體的檢測(免疫熒光法或免疫酶標法)在一定程度上欠客觀性(憑個人在顯微鏡下計算陽性細胞的百分率)、指標較粗(采用幾何級數(shù)的滴度，例如1∶20，1∶40，1∶80等，尚未采用目前數(shù)碼時代的十分具體的數(shù)字表示)，且對EB病毒感染的特征針對性不強。例如鼻咽癌主要是潛伏感染伴少量溶解性感染，鼻咽癌患者血清中大多具有廣譜的高水平的抗EB病毒抗體，特別是IgA抗體。又例如不能確切地顯示傳染性單核細胞增多癥患者血清中具特征性的抗體水平(包括：p18VCA?IgM、低親和性p18VCAIgG、p18VCA?IgG和EBNA1?IgG)。

酶聯(lián)免疫吸附法可用于鑒別EB病毒的各種感染狀態(tài)，在血清學診斷EB病毒相關疾病時，具有十分潛在的優(yōu)勢。目前雖已有采用酶聯(lián)吸附試制盒血清學診斷EB病毒相關疾病的研究報告，但缺乏處理EB病毒抗體水平的一套新方法。如何區(qū)分高、低水平，尚無比較客觀的標準。此外，應用酶聯(lián)免疫吸附法時，如何克服各批號之間的差異和采用同一批號試劑盒每次檢測之間的差異，目前尚無良方。

[發(fā)明內(nèi)容]

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒，其優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有客觀性和EB病毒抗原的特異性，它提供了定量檢測針對個體EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗體的亞型。這種優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是傳統(tǒng)的血清學檢測法做不到的，因為傳統(tǒng)的血清學檢測法并不能明確抗原的特異性。而且，新的優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)采用了參考血清，可以糾正每批檢測間的差異，保證了診斷的可靠性。

本發(fā)明選擇血清學診斷鼻咽癌(或傳染性單核細胞增多癥)最具臨床診斷價值的EB病毒蛋白(相關氨基酸序列95％的同源性)為EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截，即：

PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP

RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF

VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL

QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG

DDGDEGGDGDEGEEGQE

以及Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。采用這三種EB病毒蛋白作為靶抗原，用以檢測血清中的抗體水平，并通過在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中對EB病毒蛋白進行克隆、表達和純化，創(chuàng)制出診斷試劑盒，從而使重組EB病毒抗原在以下診斷方面得以應用：

1、EB病毒的原發(fā)性感染；

2、確立EB病毒感染的抗體譜和鑒別診斷各種EB病毒感染；

3、鑒別傳染性單核細胞增多癥(Infectious?mononucleosis)和傳染性單核細胞綜合癥(Infectious?mononucleosissyndrome)；

4、血清學協(xié)助診斷疑為鼻咽癌；

5、早期發(fā)現(xiàn)和評估患鼻咽癌的風險度。