[發(fā)明專利]一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610079938.2
• 申請日: 2003-08-20
• 公開（公告）號: CN101144817A
• 公開（公告）日: 2008-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳文翰;陳泓霖;陳國雄;吳子柏
• 申請（專利權(quán)）人: 香港神農(nóng)有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/53;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司
• 代理人: 劉孟斌

1.一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒，包括有：陽性對照血清、陰性對照血清、酶底物、終止反應(yīng)液、稀釋緩沖液、沖洗緩沖液以及EB病毒靶抗原，其特征在于EB病毒靶抗原蛋白為：EBNA1蛋白、Zta蛋白和VCA-p18蛋白，其中所述的Zta蛋白的氨基酸序列為：

MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPL

PCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQ

NQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTR

KPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL

KQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF。

2.一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒的制備方法，包括EB病毒重組抗原的制備、純化標(biāo)記、效價滴定、包被板制備、封閉、干燥及包裝、酶標(biāo)抗體濃縮液制備、稀釋液制備、陽性對照制備、正常對照制備、底物分裝、終止液及濃縮液制備等步驟，其特征在于它還包括參考血清的制備，其中EB病毒蛋白重組抗原的制備為：

A、選定EBNA1蛋白的后一截，即：

PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP

RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF

VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL

QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG

DDGDEGGDGDEGEEGQE

和Zta蛋白序列，即：

MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPL

PCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQ

NQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTR

KPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL

KQMCPSLDVDSI?IPRTPDVLHEDLLNF

以及VCA-p18蛋白序列，即：

MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVPREAQ

RSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQA

QAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGG

GGQPHDTAPRGARKKQ

這三種EB病毒蛋白在基因庫中的mRNA序列，逆轉(zhuǎn)錄酶將之轉(zhuǎn)為cDNA序列；

B、設(shè)計可以擴增該cDNA序列的引物、進(jìn)行序列擴增；

C、將PCR擴增子與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因克隆到Eco?R1/Bam?HI消化的原核細(xì)胞表達(dá)pGEX2T質(zhì)粒載體上，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌，誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)到了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，然后收獲并裂解細(xì)菌，細(xì)菌裂解產(chǎn)物經(jīng)離心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽瓊脂糖4B經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-谷胱甘肽親和色譜儀純化。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒的制備方法，其特征在于EBNA-1引物設(shè)計為：

5’-TAC?GGA?TCC?CCT?GTA?GGG?GAA?GCC?GAT?TA-3’

????????BamHI

5’-TAC?GAA?TTC?TCA?CTC?CTG?CCC?TTC?CTC?CAC-3’

????????EcoRI

。