[發(fā)明專利]一種用于蛋白質(zhì)N－端肽特異性識(shí)別與測(cè)序的方法和試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610072596.1
• 申請(qǐng)日: 2006-04-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101055266A
• 公開(kāi)（公告）日: 2007-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢(qián)小紅;劉新;周春喜;應(yīng)萬(wàn)濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N1/28
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)N-端肽段特異性識(shí)別與質(zhì)譜測(cè)序的新方法和試劑盒。

背景技術(shù)

眾所周知，蛋白質(zhì)的N端信息對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)確定及功能闡述都非常重要。一方面，蛋白質(zhì)的N端序列標(biāo)簽具有很高的特異性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，43％至83％的蛋白質(zhì)具有獨(dú)特的N端4殘基標(biāo)簽[Wilkins，M.R.，Gasteiger，E.，Tonella，L.，Ou，K.et?al，J.Mol.Biol.1998，278，599-608.]。另一方面，蛋白質(zhì)的N端序列有助于確證蛋白質(zhì)的N端加工[Chung，J.J.，Shikano，S.，Hanyu，Y.，Li，M.，Trends?Cell?Biol.2002，12，146-150.]。雖然蛋白質(zhì)的N-端肽段包含重要的生物學(xué)信息，但是由于蛋白酶切過(guò)程中，大量非末端肽段的產(chǎn)生對(duì)于特異性識(shí)別和鑒定蛋白質(zhì)的N-端肽段造成困難。Edman降解是一種常規(guī)的蛋白質(zhì)的N-端鑒定方法，但是相對(duì)較高的測(cè)序費(fèi)用以及非N-端肽信息的缺少，成為這種測(cè)序方法的不足。隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，雖然文獻(xiàn)中有一些富集或鑒定蛋白質(zhì)N端的方法[Yamaguchi，M.，Nakazawa，T.，Kuyama，H.，Obama，T.et?al，Anal.Chem.2005，77，645-651]，但目前并沒(méi)有一個(gè)簡(jiǎn)單易行的方法可從復(fù)雜的蛋白酶切肽段中特異性識(shí)別蛋白N-末端并對(duì)其進(jìn)行有效測(cè)序。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單有效，既可特異性識(shí)別蛋白質(zhì)N-端肽段，又可促進(jìn)其質(zhì)譜測(cè)序，從而提高蛋白質(zhì)N-端肽段序列分析確定性和可靠性的方法。步驟包括：

(a)用一種或多種胍基化試劑對(duì)蛋白的側(cè)鏈氨基進(jìn)行修飾，封閉蛋白所有側(cè)鏈氨基；

(b)用一種或多種化學(xué)試劑對(duì)蛋白質(zhì)N-端氨基進(jìn)行修飾；

(c)用一種或多種還原劑打開(kāi)蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)；

(d)用一種或多種烷基化試劑封閉疏基防止其重新形成二硫鍵；

(e)用一種或多種化學(xué)消化或酶消化法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，以產(chǎn)生適于質(zhì)譜分析的肽段；

(f)用質(zhì)譜分析技術(shù)特異性識(shí)別并分析蛋白質(zhì)N端肽段，產(chǎn)生二級(jí)質(zhì)譜圖；

(g)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，以鑒定蛋白質(zhì)并得到蛋白質(zhì)的N端序列信息。

其特征在于所述步驟(b)的修飾方法為：

用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的酸酐試劑，特異性對(duì)蛋白質(zhì)N-端氨基進(jìn)行修飾；再用一種或多種含游離氨基的化學(xué)試劑，對(duì)蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)進(jìn)行終止。

上述穩(wěn)定同位素標(biāo)記的酸酐試劑優(yōu)選乙酸酐、丙酸酐或琥珀酸酐；更優(yōu)選d0/d6-乙酸酐試劑。

上述含游離氨基的化學(xué)試劑優(yōu)選三羥乙基氨基甲烷或賴氨酸。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，還提供了一種更優(yōu)選的修飾方法，即用d0/d6-乙酸酐試劑對(duì)蛋白質(zhì)N-端氨基進(jìn)行修飾；再用三羥乙基氨基甲烷或賴氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)進(jìn)行終止。

該方法在整體蛋白質(zhì)水平上通過(guò)胍基化修飾封閉側(cè)鏈氨基，然后通過(guò)同位素標(biāo)記的酸酐試劑在整體蛋白水平上特異性修飾其N(xiāo)-末端氨基，酶切后，通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的N-末端的特異性識(shí)別及末端測(cè)序分析。特異性標(biāo)記的蛋白N-末端在質(zhì)譜中會(huì)出現(xiàn)特征性的一對(duì)同位素峰而區(qū)別于其他非末端酶解肽段，因而容易識(shí)別，同時(shí)胍基化修飾使賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔彼?，可以顯著增強(qiáng)肽段的質(zhì)譜信號(hào)和檢測(cè)靈敏度，促進(jìn)肽段離子的裂解，簡(jiǎn)化其二級(jí)質(zhì)譜圖，從而有助于其序列分析。

利用本方法，特異性識(shí)別蛋白質(zhì)的N-端肽段，顯著提高了N端肽被質(zhì)譜鑒定的確定性，二級(jí)質(zhì)譜圖的質(zhì)量明顯改善，可根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖對(duì)蛋白質(zhì)末端肽進(jìn)行從頭測(cè)序，提供一種非Edman蛋白N-末端測(cè)序方法。

本發(fā)明還涉及用于方便實(shí)施本方法的試劑盒。該試劑盒含有：

(a)用于特異性標(biāo)記蛋白N-末端氨基的一種或多種同位素標(biāo)記的酸酐試劑；

(b)對(duì)蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)進(jìn)行終止的一種或多種含游離氨基的化學(xué)試劑。

其中組分(a)優(yōu)選同位素標(biāo)記的乙酸酐、丙酸酐或琥珀酸酐，更優(yōu)選d0/d6-乙酸酐試劑；組分(b)優(yōu)選三羥乙基氨基甲烷或賴氨酸。

為方便使用，該試劑盒還可包含以下組分中的一種或多種：(a)一種或多種胍基化試劑，優(yōu)選o-甲基異脲，對(duì)蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基進(jìn)行修飾，使賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔彼幔?b)一種或多種還原劑，優(yōu)選二硫蘇糖醇(DTT)；(c)一種或多種烷基化試劑，優(yōu)選碘乙酰胺；(d)一種或多種蛋白質(zhì)消化劑，優(yōu)選胰蛋白酶；(e)一種或多種蛋白質(zhì)變性劑或增溶劑；(f)方法的操作說(shuō)明。