[發明專利]一種從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法

無效

• 申請號: 200610054049.0
• 申請日: 2006-01-23
• 公開（公告）號: CN1807580B
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 夏玉先;張滄桑;王中康;殷幼平;彭國雄
• 申請（專利權）人: 重慶大學;重慶重大生物技術發展有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12S3/22;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及一種從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法。

背景技術

目前對于昆蟲病原真菌致病基因的研究，主要是建立在不同離體條件下的誘導表達序列標簽庫(以下稱EST庫)，如通過建立金龜子綠僵菌(廣譜菌株)在不同離體條件下的誘導EST庫，分析大量EST序列，以期利用大量不同離體條件下的誘導EST序列分析病原真菌在侵入寄主昆蟲體內后基因的表達情況等，但此方法既耗時、又費力，并且難以檢測在活體條件下特異表達的病原真菌基因。

而在病原真菌侵染后的寄主昆蟲血淋巴中分離純化到無寄主DNA和RNA污染的病原真菌菌體是分離和克隆病原真菌在寄主體內表達基因的關鍵技術。從寄主昆蟲體內直接獲取病原真菌菌體，以分離和克隆昆蟲病原真菌菌體侵入昆蟲體內后表達的基因，研究它們在致病機理中的作用，一直是業內人士渴望解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從感病昆蟲血淋巴中直接分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法。

本發明的目的是這樣實現的：一種從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法，其特征在于：將感病昆蟲的血細胞采用酶處理進行裂解及其DNA和RNA采用酶處理進行降解，再加以分離沉淀，純化制得病原真菌菌體；在整個酶解過程中，采用聚合酶鏈式反應(以下稱PCR)檢測保守序列監控，最后采用PCR和逆轉錄-聚合酶鏈式反應(以下稱RT-PCR)檢測保守序列方法對昆蟲病原真菌菌體進行鑒定。

上述感病昆蟲的血細胞經超純水處理、離心分離后，其沉淀與蛋白酶K進行裂解反應；裂解反應完成后，其離心沉淀與核酸酶進行降解反應，以降解其RNA和DNA，最終分離出的沉淀為昆蟲病原真菌菌體和細胞碎片；在整個酶解過程中，采用昆蟲的保守基因序列設計昆蟲特異性引物來檢測昆蟲核酸是否存在，昆蟲病原真菌保守基因序列設計昆蟲病原真菌的特異性引物作為檢測有無昆蟲病原真菌核酸的存在，通過PCR和RT-PCR擴增檢測酶解后檢測昆蟲的保守基因序列量的多少及有無來判斷酶切進程，實現對整個酶切過程的全過程監控以及對昆蟲病原菌菌體進行鑒定。

上述感病昆蟲是指東亞飛蝗，上述病原真菌是指綠僵菌；上述感病東亞飛蝗的血細胞中加入超純水洗滌，血細胞數∶超純水的體積＝3.0×10⁶個∶1000-2000μl；洗滌、離心分離除去上清液的血細胞中加入細胞裂解緩沖液，血細胞數∶細胞裂解緩沖液的體積＝1.0×10⁶個∶100-200μl，混勻后加入10％十二烷基磺酸鈉(SDS)至終濃度為1％，混勻后加入蛋白酶K后，30℃水浴1～2小時，離心分離棄去上清液，洗滌沉淀；再在沉淀中加入核酸降解緩沖液，其加入量以前面所計的感病東亞飛蝗的血細胞數加入核酸降解緩沖液，血細胞數∶核酸降解緩沖液的體積＝1.0×10⁶個∶100-200μl，再加入脫氧核糖核酸酶DNAase?I、核糖核酸酶RNAase?A，使其終濃度均為0.5mg/ml，混勻后30℃水浴30-45分鐘，離心分離棄去上清液，洗滌沉淀；每次洗滌后的上清液，取10μl作模板進行PCR反應，2％瓊脂糖凝膠電泳，以分析東亞飛蝗血細胞的裂解及DNA、RNA的降解的情況；從沉淀中提取DNA或mRNA，并用東亞飛蝗特異性引物和綠僵菌特異性引物做PCR和RT-PCR，以驗證是否污染了東亞飛蝗的遺傳物質及沉淀是否為綠僵菌菌體。

本發明所采用的蝗蟲保守基因為蝗蟲的組蛋白基因，并以其保守區段來設計的引物是

H1：5-’ACCAAGGCGGCGAGGAAGA-3’；

H2：5’-TCGAAGAGGCCGACGAGGTAG-3’

本發明所采用的病原真菌菌體保守基因序列為綠僵菌管蛋白基因，并以其保守區段來設計的引物是

T3：5’-AGCCGACCATGAAGAAGTGC-3’，

T4：5’-TGCCTCCAGGGTTTCCAGAT-3’

當然本發明的監控過程中，也可用其他保守序列作為監控序列，但需要注意的是，在所選的這兩段序列中，不能含有相似的片段，而且根據這兩段序列可設計出比較特異的引物，在供試的樣本中只能擴增出單一目的帶。