[發明專利]一種從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法

無效

• 申請號: 200610054049.0
• 申請日: 2006-01-23
• 公開（公告）號: CN1807580B
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 夏玉先;張滄桑;王中康;殷幼平;彭國雄
• 申請（專利權）人: 重慶大學;重慶重大生物技術發展有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12S3/22;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.一種從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法，其特征在于：將感病昆蟲的血細胞采用蛋白酶K處理進行裂解及其DNA和RNA采用酶處理進行降解，再加以分離沉淀，純化制得病原真菌菌體；在整個酶解過程中，采用聚合酶鏈式反應(以下稱PCR)檢測保守序列監控，最后采用PCR和逆轉錄-聚合酶鏈式反應(以下稱RT-PCR)檢測保守序列方法對昆蟲病原真菌菌體進行鑒定。

2.如權利要求1所述的從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法，其特征在于：所述感病昆蟲的血細胞經超純水處理、離心分離后，其沉淀與蛋白酶K進行裂解反應；裂解反應完成后，其離心沉淀與核酸酶進行降解反應，以降解其RNA和DNA，最終分離出的沉淀為昆蟲病原真菌菌體和細胞碎片；在整個酶解過程中，將昆蟲的保守序列來檢測昆蟲核酸是否存在；昆蟲病原真菌保守基因序列設計昆蟲病原真菌的引物，作為檢測有無昆蟲病原真菌核酸的存在；通過PCR和RT-PCR擴增檢測酶解后檢測昆蟲的保守基因的多少及有無來判斷酶切進程，實現對整個酶切過程的全過程監控以及對昆蟲病原真菌菌體進行鑒定。

3.如權利要求1或2所述的從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法，其特征在于：所述感病昆蟲是指東亞飛蝗，所述病原真菌是指綠僵菌；所述感病東亞飛蝗的血細胞中加入超純水洗滌，血細胞數∶超純水的體積＝3.0×10⁶個∶1000-2000μl；洗滌、離心分離除去上清液的血細胞中加入細胞裂解緩沖液，血細胞數∶細胞裂解緩沖液的體積＝1.0×10⁶個∶100-200μl，混勻后加入10％十二烷基磺酸鈉(SDS)至終濃度為1％，混勻后加入蛋白酶K后，30℃水浴1～2小時，離心分離棄去上清液，洗滌沉淀；再在沉淀中加入核酸降解緩沖液，其加入量：前面所計血細胞數∶核酸降解緩沖液的體積＝1.0×10⁶個∶100-200μl，再加入脫氧核糖核酸酶DNAase?I、核糖核酸酶RNAase?A、使其終濃度均為0.5mg/ml，混勻后30℃水浴30-45分鐘，離心分離棄去上清液，洗滌沉淀；每次洗滌后的上清液，取10μl作模板進行PCR反應，2％瓊脂糖凝膠電泳，以分析東亞飛蝗血細胞的裂解及DNA、RNA的降解的情況：從沉淀中提取DNA或mRNA，并用東亞飛蝗特異性引物和綠僵菌特異性引物做PCR和RT-PCR，以驗證是否污染了東亞飛蝗的遺傳物質及沉淀是否為綠僵菌菌體。

4.如權利要求3所述的從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法，其特征在于：所采用的蝗蟲保守基因為蝗蟲的組蛋白基因，并以其保守區段來設計的引物是

H1：5-’ACCAAGGCGGCGAGGAAGA-3’；

H2：5’-TCGAAGAGGCCGACGAGGTAG-3’

所采用的病原真菌菌體保守基因序列為綠僵菌管蛋白基因，并以其保守區段來設計的引物是

T3：5’-AGCCGACCATGAAGAAGTGC-3’，

T4：5’-TGCCTCCAGGGTTTCCAGAT-3’。

5.如權利要求3所述的從感病昆蟲血淋巴中分離純化昆蟲病原真菌菌體的方法，其特征在于：所述細胞裂解緩沖液是由0.606g三羥甲基氨基甲烷，0.584g氯化鈉，0.102g六水氯化鎂，加80ml去離子水溶解，用鹽酸調節pH值至8.0，加水定容至100ml組成；上述核酸降解緩沖液是由0.606g三羥甲基氨基甲烷，0.058g氯化鈉，0.584g六水氯化鎂，加80ml去離子水溶解，用鹽酸調節pH值至7.5，加水定容至100ml組成。