[發明專利]層疊雜交熒光放大磁分離檢測DNA的方法

無效

• 申請號: 200610035695.2
• 申請日: 2006-05-31
• 公開（公告）號: CN101082583A
• 公開（公告）日: 2007-12-05
• 發明（設計）人: 聶立波;賀全國;陳洪;何農躍
• 申請（專利權）人: 中山耐樂生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 中山市科創專利代理有限公司
• 代理人: 尹文濤

【技術領域】

本發明涉及一種檢測DNA的方法。

【背景技術】

自1953年華特遜(Watson)和克瑞克(Crick)創立生物遺傳分子脫氧核糖核酸(DNA)的雙螺旋結構和建立生物遺傳基因的分子機理以來，有關DNA分子的識別、測序一直為人們所關注。1990年美國制定了世界最龐大的基因研究計劃“人類基因組計劃”，隨著人類基因草圖的公布，人們正在深入開展后基因組計劃研究，為此，國際上掀起了有關生物芯片和生物傳感器的研究熱潮?；蚩刂浦祟惿纳喜∷肋^程，隨著對基因與癌癥及其它與基因有關病癥的了解，在分子水平上檢測易感物種及基因突變，對于疾病的治療及預后有著重要的意義。比如，歷史上許多災難性的瘟疫(如霍亂、天花、麻疹等)，以及當前對人類造成嚴重威脅與恐慌的流行性疾病(如SARS，禽流感)都是由相應的病菌或病毒所引起的，因此及時盡早診斷出病源微生物的感染，是預防這類疾病的關鍵。對于許多基因疾病(如眾多癌癥、帕金森氏綜合癥、阿爾茨海默氏病等)，只有在發病的前期發現，才有治愈的希望。另外，人類的許多疾病都是以環境為載體進行傳播的。當環境中存在病原微生物或基因誘變劑時，就會對人類的健康產生極大的威脅。如果能及時發現環境中病原物的存在，就可以盡早進行疾病預防，防止引起人體感染。因此，為實現對疾病的早期診斷乃至超前診斷，提高人類的生存質量，加強對DNA檢測方法的研究和應用開發，實現DNA的低濃度檢測具有重要的科學意義和應用價值。

在各種不同的基因檢測技術中，制約其發展和應用的一個非常重要的因素是檢測靈敏度。比如，對于濾過性病毒感染，需要檢測的DNA量在10-15摩爾/升或10-18摩爾/升水平。為達到這樣低的檢測限，必須通過擴增樣本量或尋求放大檢測信號的方法。目前，新型納米材料在生物分析中的應用成為一個快速發展的領域。過去10年來，納米材料在生物大分子超靈敏識別分析和生物信息獲取方面的基礎與應用研究在國際上一直受到高度重視。研究的熱點主要集中在熒光材料標記物、納米金、納米銀、氧化硅納米顆粒等納米材料的制備與應用上，各種各樣的納米結構決定了它們在生物檢測中的應用特性。

在納米熒光標記材料的研究中，分子信標的研究是最新研究進展之一。所謂分子信標(molecular?beacon)，是一種具有發夾結構的新型熒光核酸探針。自由狀態時的分子信標呈發夾結構，此時由于熒光基團與猝滅基團靠得很近，熒光被猝滅；當與靶序列結合后，分子信標的空間構型發生改變，熒光恢復。近年來人們對這種具有諸多優良特性的寡核苷酸探針進行了大量的試驗，對其結構特性以及在各方面的應用展開了廣泛而深入的研究，做出了許多改進，使其在序列檢測、病原體偵測、藥物療效監測、區分基因野生型和突變型、DNA-蛋白相互作用研究、定量聚合酶鏈擴增(PCR)、以及體外轉錄反應中的RNA實時檢測等眾多領域中得到應用。例如，可用分子信標對活細胞中mRNA進行監測，并應用于DNA/RNA超小生物傳感器及蛋白質實時檢測。隨著生物納米技術的發展，最近杜貝垂(Dubertret)等嘗試用1.4nm的納米金作為猝滅基團。與常規猝滅基團DABCYL相比，納米金可以在可見到近紅外的波長范圍內，有效的猝滅各種熒光染料。而且金顆粒在較低的離子強度條件下吸收效果較好。納米金的引入，不僅可以降低分子信標制備成本，而且研究結果表明，這種技術對單堿基錯配序列更為敏感，特別適合于在眾多相似序列中高靈敏地檢測出靶序列。例如，可在競爭性雜交陣列中高靈敏地檢測出單堿基突變。目前的問題是需要進一步改善納米金與DNA之間結合的穩定性，以免消除分子信標過程中納米金掉下而影響猝滅效果。