[發明專利]一種基于磁性納米粒子聚合酶鏈式反應(PCR)的單核苷酸多態性(SNP)高通量分型方法

無效

• 申請號: 200610032203.4
• 申請日: 2006-09-06
• 公開（公告）號: CN101139636A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 劉洪娜;何農躍;李松;賀全國;陸祖宏;林琳
• 申請（專利權）人: 劉洪娜;何農躍
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域

本發明涉及一種新型的單核苷酸多態性的分型方法。利用磁性納米粒子聚合酶鏈式反應(MNPs-PCR)和等位基因特異性雜交相結合的方法，來實現對大量樣本的功能SNP位點的分型。該技術具有高通量、方便、適用、可靠性高的基礎上，使其操作步驟大大簡化。

背景技術

單核苷酸多態性(SNP)是指基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1％。盡管遺傳密碼由4種堿基組成，但SNP通常只是1種二等位基因(biallelic)或二態的遺傳變異。SNPs是人類基因序列中最常見的變異，對他們的研究有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對復雜疾病的易感性、以及對各種藥物的耐受性和對環境因子的反應。因此，建立一種快速、準確、高通量且適用于臨床的SNP分型方法非常重要。

目前已報道的眾多SNP分型方法中，常用的方法分為三大類：以分子構象不同為基礎的檢測方法，以熒光共振能量傳遞(fluorescence?resonance?energy?transfer，FRET)為基礎的檢測方法，此外還有以分子雜交技術為基礎的檢測方法。現有的各種SNP檢測方法可以對DNA樣品實施快速、準確的基因分型，但這些方法還存在各自的不足之處。如基于分子構象不同的檢測方法，其方法只能檢測到突變，但不能給出序列信息，而無法確定具體突變位點與突變形式，同時此類方法對操作者的要求很高。而以熒光共振能量傳遞為基礎的各種檢測方法，還存在成本過高或者通量低等缺點。以分子雜交技術為基礎的SNP分型方法中，絕大多數需要對包含有SNP位點的PCR產物進行純化、濃縮，這是一個即費時又費力的工作。

隨著納米技術的迅速發展，納米材料逐漸被應用到生命科學領域，為其研究和發展提供了新的技術和手段。磁性納米粒子(MNPs)作為納米材料的一個重要組成部分，由于其特殊的物理化學性質和生物相容性，目前已被廣泛應用于細胞的分離、免疫測定、蛋白質和酶的固定以及DNA的檢測等。聚合酶鏈反應(PCR)是一種體外特定核酸序列擴增技術，是現代分子生物學的實驗工作基礎之一，在生命科學遺傳學和醫學等領域發揮著重要作用。PCR通常在均一的溶液中進行，近年來，國外有些人分別研究了微孔表面、玻璃表面、尼龍表面的PCR。國內上海師范大學沈鶴柏等人隨后也建立了基于納米粒子的PCR技術，他將均相體系中的PCR技術擴展到納米粒子表面，為制備納米粒子表面的ssDNA提供了新的方法。

發明目的

本發明提供一個以磁性納米粒子PCR為基礎，操作簡單、結果可靠、便于自動化的高通量SNP檢測方法。該方法利用了磁性納米粒子的優點，通過在磁性顆粒表面直接擴增靶序列的方法，克服了現有技術中對待檢測靶序列進行純化、濃縮而導致的成本高、費時、費力等缺陷，從而具有簡便、高效、準確地對大量樣品進行SNP分型的優點。

發明內容

本發明的目的通過下述方案實現：

基于磁性納米粒子PCR的SNP分型方法，包括下述步驟：

(1)選取待檢測的重要功能SNP位點。設計一對擴增引物，其中一條引物5’端進行標記(生物素或者氨基)。

(2)針對步驟(1)中選取的SNP位點，設計兩條分別與兩種等位基因互補的野生和突變檢測探針，待檢測位點位于探針序列的中間且每條探針的一端帶有標記物。

(3)通過共價結合，將一端有標記物的引物固定在標記物修飾的磁性納米粒子上，在含有自由引物、dNTP、聚合酶和模板DNA的體系中進行PCR反應，直接在磁性納米粒子表面擴增出包含有待測SNP位點的靶序列，構成磁性納米粒子-DNA復合物(MNPs-DNA)。

(4)上述步驟(3)MNPs-DNA復合物變性、洗滌后于步驟(2)中的檢測探針在最優溫度下雜交，野生純合型樣本只與野生探針匹配，突變純合型樣本只與突變探針匹配，雜合型樣本與兩種探針均匹配。

(5)將雜交有檢測探針的磁性納米粒子經洗滌、變性、磁分離后，通過檢測變性下來探針上的標記物來實現對樣本的SNP分型。

當所述步驟(1)中，標記引物的方法為生物素或者氨基，對應步驟

(3)修飾磁性納米粒子的標記物分別是親合素或醛基，通過生物素-親合素或者氨基-醛基之間的共價結合，直接在磁性納米粒子表面固定單側引物。