[發明專利]重組人甲狀旁腺素(1～34肽)的串聯表達方法

無效

• 申請號: 200610030690.0
• 申請日: 2006-08-31
• 公開（公告）號: CN101134963A
• 公開（公告）日: 2008-03-05
• 發明（設計）人: 黃陽濱;孫九如;張翊;任軍;梁光軍;邱燕
• 申請（專利權）人: 上海新生源醫藥研究有限公司;上海新生源生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C07K14/635;C12N15/66;C12P21/02;C12N1/21
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1.一種編碼重組人甲狀旁腺素(1～34肽)的DNA序列，其特征在于，其編碼如SEQID?NO：2所示的氨基酸序列，其與SEQ?ID?NO：1所示的DNA序列有95％的同源性。

2.一種含有編碼串聯蛋白基因的表達載體的制備方法，其特征在于，它包括步驟：

a.在每個單體基因前5’端引入一個Lys(K)、Arg(R)和BglII酶切位點，在其3’端引入一個Lys(K)、Arg(R)和BamHI酶切位點。

b.通過PCR擴增得到目的人甲狀旁腺素(1～34肽)基因，PCR產物經BglII、BamHI雙酶切后，回收目的片斷；

c.在合適的條件下，通過BglII+BamHI位點連接入表達載體，獲得載體/PTH1，BglII+BamHI雙酶切載體/PTH1，獲得PTH1-BglII-BamHI，將PTH1-BglII-BamHI連接入經過BamHI和堿性磷酸酶處理后獲得的載體/PTH1載體片段，獲得載體/PTH2，再以同樣的方法獲得載體/PTH2，如此循環，可以獲得含有編碼串聯蛋白基因的表達載體。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的單體基因是核苷酸序列。較佳地，所述的單體基因是如權利要求1所述的核苷酸序列。

4.一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求2所述的DNA序列。較佳地，所述的表達載體是pThioHisA/PTH-fusion。

5.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求4所述的表達載體或權利要求2所述的編碼串聯重組人甲狀旁腺素(1～34肽)的DNA序列。

6.一種生產重組人甲狀旁腺素(1～34肽)的方法，其特征在于，它包括步驟：

a)在適合的表達條件下，培養如權利要求5所述的宿主細胞，從而表達出重組人甲狀旁腺素(1～34肽)串聯蛋白；

b)分離純化出表達的人甲狀旁腺素(1～34肽)蛋白。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的宿主細胞是大腸桿菌。

8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中進行高密度懸浮培養。

9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步驟(b)包括步驟：

i)對發酵樣品通過離心和/或過濾方式去除上清，獲得發酵后菌體；

ii)對發酵沉淀進行壓榨破菌、收集壓榨上清；

iii)層析純化，所述的層析選自：陰離子交換層析、金屬螯和親和層析、陽離子交換層析及其組合。

iv)采用腸激酶EK酶切后，經進一步純化及羧肽酶B和Kex2酶切后獲得目的蛋白。對發酵樣品通過離心和/或過濾方式去除上清，獲得發酵后菌體；