[發明專利]重組人甲狀旁腺素(1～34肽)的串聯表達方法

無效

• 申請號: 200610030690.0
• 申請日: 2006-08-31
• 公開（公告）號: CN101134963A
• 公開（公告）日: 2008-03-05
• 發明（設計）人: 黃陽濱;孫九如;張翊;任軍;梁光軍;邱燕
• 申請（專利權）人: 上海新生源醫藥研究有限公司;上海新生源生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C07K14/635;C12N15/66;C12P21/02;C12N1/21
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技術領域

本發明涉及基因工程領域。更具體地，本發明提供了一種高效生產重組人甲狀旁腺素(1～34)肽的方法，包括有關的串聯體的獲得、工程菌的構建、重組人甲狀旁腺素(1～34)肽串聯體的表達和相應的純化工藝。

背景技術

1925年，Collip從牛甲狀旁腺組織中分離到甲狀旁腺激素，但提取產物不穩定，活性組分不單一，之后Aurbach(1959)用酚抽提獲得了均一穩定的產物直到1974年Henry等用酚、三氯乙酸及柱層析才獲得純度很高的產物，并使之用于生物學功能及化學結構方面的研究。

人甲狀旁腺素(human?parathyroid?hormone，PTH)是一種直鏈多肽激素，由84個氨基酸組成，N端1～34肽段具有完整的生物學功能。

鈣在體內對維持肌肉收縮、細胞膜特性、酶活性、骨組織的成熟等方面發揮著重要作用；磷則是遺傳物質和細胞膜的重要組分，同時在代謝過程中成為能量轉換的媒介。維持鈣和磷在體內的相對平衡對機體是十分重要的。甲狀旁腺素就是在人體內起調節鈣、磷代謝，使血液中鈣磷濃度相對穩定的一種因子。甲狀旁腺素屬多肽激素，由一條多肽鏈組成，分子中不含半胱氨酸和酪氨酸，分子量為9425，等電點為9.58，含84個氨基酸殘基。人血漿中PTH有三種存在形式，除了完整的激素外，還包括分子量約7000和4500兩種降解產物。

hPTH通過對腎和骨的作用成為體內最重要的鈣磷代謝平衡的調節因子。PTH直接作用于骨，可使Ca2+釋放，血Ca2+濃度升高。能促進成骨細胞的消失和破骨細胞的增殖。PTH還作用于腎臟的近球小管，抑制磷的重吸收，增加尿磷的排出，促進腎小管上皮細胞對Ca2+的重吸收，使血Ca2+濃度升高，臨床上如果PTH分泌速度過快，就會導致持續的不正常的激素濃度。骨的重吸收代替了骨的形成，導致病理上的甲旁亢。如果PTH的活性片段在較低或中等劑量的濃度下長時間作用于骨，就會刺激骨的形成并且通過誘導骨中的合成作用而有效地治療骨質疏松癥。反之，在甲狀旁腺機能減退或缺損時，就會引起肌肉痙攣和手足抽搐。PTH主要是和腎、骨組織中的受體相結合而調節細胞外鈣磷的濃度。最初的步驟至少是通過激素受體復合物對于腺苷酸環化酶信號系統的激活，通過增加cAMP的濃度而發揮效應。PTH還通過腎中25-羥-維生素D3轉化為活性形式的1，25-二羥-維生素D3的間接作用而保持鈣濃度的平衡和骨的形成。PTH還有舒張主動脈，減少外周血管阻力，降低血壓，增加輸出量的作用。這可能由于影響了細胞膜鈣通道Ca2+/ATP酶泵活動，減少了鈣的跨膜內流。另外PTH還通過促進心肌細胞穿膜鈣內流而對心臟產生作用。因此PTH在生物學及醫學方面都受到人們的關注。

隨著甲狀旁腺激素的發現，人們一直在努力試圖大量獲得，用于結構功能的研究和骨、肌肉疾病的治療。起初是從人、豬、牛甲狀旁腺組織提取，這種方法提取效率及產量很低。據資料記載。從歐洲及北美許多醫院手術切除積累的50g甲狀旁腺腫瘤組織中才能獲得3.2mg甲狀旁腺激素。生物工程技術的興起及發展使得生物大分子的體外表達成為可能。PTH基因序列的闡明也為建立體外高效表達體系的研究奠定了基礎。Born等(1987)將preproPTH基因導人到大腸桿菌中進行了表達，發現prepro序列不能提高PTH的分泌表達，可能是由于原核生物對真核生物的prepro序列不能識別。隨后，Born等將目光轉向酵母，然而天然蛋白質在酵母細胞中表達很不穩定，另外一個問題是酵母細胞不易破碎。因此，preproPTH基因在酵母中表達產量較大腸桿菌體系沒有明顯的提高。Rabbani等(1988)將人工合成的PTH基因在大腸桿菌中表達，產物不均一，包括了PTH(8-84)，PTH(3-84)，fMet-PTH和完整PTH。為了提高目標產物的穩定性，人們想到用融合蛋白形式。Hogset等(1990)采用金黃色葡萄球菌蛋白A的啟動子和信號肚序列在大腸桿菌中表達PTH，產物分泌到培養基中，分離純化方法簡單迅速。酵母б因子表達系統也是比較理想的融合蛋白表達體系，即用外源基因代替α因子的編碼序列，外源蛋白會與α因子引導肽形成融合蛋白。在一系列與膜相關的蛋白運輸和分泌過程中，融合蛋白在KEX2基因產物類胰蛋白酶和STE13基因產物二肽氨肽酶作用下生成具有正確高級結構的外源蛋白。這些外源蛋白或直接分泌到培養基中或在細胞周質空間積累。采用α因子表達系統在啤酒酵母中表達PTH，也出現產物不均一現象，除了完整PTH，還有兩個不同的糖基化形式。