[發(fā)明專利]嗜中性顆粒蛋白NGP的表達(dá)和純化

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610027829.6
• 申請(qǐng)日: 2006-06-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101092616A
• 公開(kāi)（公告）日: 2007-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫兵;謝德鄂;劉智多;李振虎;鐘超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12N15/12;C12N15/63;C12N15/62;C07K19/00;C07K14/435;C12N1/21;C12N15/65;A61K38/17
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 徐迅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程研究領(lǐng)域，具體涉及在宿主細(xì)胞中嗜中性顆粒蛋白(neutrophil?granule?protein)的表達(dá)和純化。

背景技術(shù)

嗜中性顆粒蛋白(NGP)的分子量為19.33kDa，在N端有一個(gè)糖基化位點(diǎn)；軟件分析發(fā)現(xiàn)其氨基末端還有一個(gè)22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，提示其可能是一個(gè)分泌蛋白。根據(jù)報(bào)道NGP特異性表達(dá)于骨髓源細(xì)胞中，在前髓細(xì)胞(promyelocytes)中表達(dá)量最高；免疫電鏡分析，NGP定位于嗜中性顆粒細(xì)胞。結(jié)構(gòu)域(Domain)分析發(fā)現(xiàn)NGP含有一個(gè)塞特亭樣結(jié)構(gòu)域(cytatin-likedomain)，隸屬于塞特亭(cystatin)家族。

Cystatin是一類廣泛分布于生物體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶抑制劑，參與各種生理和病理過(guò)程。從目前國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展來(lái)看，cytatin家族成員在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用：1)調(diào)節(jié)溶酶體內(nèi)恒定鏈Ii的降解和MHC-II分子的成熟，從而調(diào)節(jié)MHC-II限制的抗原遞呈；2)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，抑制T細(xì)胞生長(zhǎng)分化和巨噬細(xì)胞的功能；3)上調(diào)干擾素γ(IFN-γ)活化的MPMs一氧化氮的合成量。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于NGP功能的研究很少，根據(jù)Science?Paper(TheTranscriptional?landscape?of?the?Mammalian?Genome；2005?Sep2；309(5740)：1559-63)中預(yù)測(cè)：其可能具有(i)半胱氨酸蛋白酶抑制劑活性；(ii)殺菌殺蟲的抗菌肽活性。但目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)或報(bào)道。

由此可見(jiàn)，NGP具有很大的研究?jī)r(jià)值，在體外大量表達(dá)和純化嗜中性顆粒蛋白NGP以探索其重要的生物學(xué)功能將具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。但是，目前現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有一種成功地大量表達(dá)和純化嗜中性顆粒蛋白NGP的方法，從而給NGP功能的進(jìn)一步研究造成了瓶頸；并且，目前本領(lǐng)域中也沒(méi)有對(duì)NGP的功能作深入的研究和試驗(yàn)來(lái)證實(shí)其功能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)嗜中性顆粒蛋白NGP的方法。

本發(fā)明的目的還在于提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體可以被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，表達(dá)嗜中性顆粒蛋白NGP。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備嗜中性顆粒蛋白NGP的方法，包括以下步驟：

(a)PCR擴(kuò)增獲得嗜中性顆粒蛋白NGP的編碼序列；

(b)將(a)所述的嗜中性顆粒蛋白NGP的編碼序列插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中，獲得插入了嗜中性顆粒蛋白NGP編碼序列的表達(dá)載體；

(c)使(b)獲得的插入了嗜中性顆粒蛋白NGP編碼序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；

(d)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出嗜中性顆粒蛋白NGP；

(e)分離獲得嗜中性顆粒蛋白NGP。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的嗜中性顆粒蛋白NGP是：嗜中性顆粒蛋白NGP與GST形成的融合蛋白。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在步驟(e)中將所述的表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)破碎細(xì)胞，并通過(guò)GST親和層析的方法純化。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，通過(guò)PCR擴(kuò)增嗜中性顆粒蛋白NGP的基因，并且，在PCR擴(kuò)增時(shí)，采用LA-Taq?DNA聚合酶作為DNA聚合酶。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在步驟(a)和(b)之間，還包括步驟：對(duì)擴(kuò)增獲得的嗜中性顆粒蛋白NGP的編碼序列進(jìn)行測(cè)序鑒定。(例如，將帶有信號(hào)肽的嗜中性顆粒蛋白NGP基因克隆入過(guò)渡載體，以含有帶有信號(hào)肽的嗜中性顆粒蛋白NGP的過(guò)渡載體為模板，擴(kuò)增嗜中性顆粒蛋白NGP基因。)

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的過(guò)渡載體選自：pEGF-N1載體、或pEGF-C1。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體包括但不限于：pGEX-4t-1等系列表達(dá)質(zhì)粒。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括但不限于：大腸桿菌BL21。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的方法包括以下步驟：

(a)用PCR技術(shù)從T細(xì)胞cDNA文庫(kù)中獲得嗜中性顆粒蛋白NGP/CDS的DNA片段；

(b)將NGP/CDS的DNA片段克隆進(jìn)pEGF-N1載體，構(gòu)建過(guò)渡載體NGP/CDS-pEGF-N1：

(c)以NGP/CDS-pEGF-N1為模板，PCR拉出去除信號(hào)肽后的嗜中性顆粒蛋白NGP；

(d)將嗜中性顆粒蛋白NGP克隆進(jìn)pGEX-4t-1，構(gòu)建NGP-pGEX-4t-1表達(dá)載體；