[發明專利]一種嗜熱α－淀粉酶的制備純化方法

有效

• 申請號: 200610025974.0
• 申請日: 2006-04-24
• 公開（公告）號: CN101063115A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 張毅;王麗薩;楊勝利
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N9/28
• 分類號: C12N9/28;C12P19/14;C12P19/02
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 徐迅

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及重組蛋白質與嗜熱酶的提取、純化。

背景技術

耐高溫α-淀粉酶是工業上最常用的酶制劑之一，廣泛使用于食品工業、化工工業中的淀粉加工。尋求與開發耐受高熱的淀粉酶長期以來始終是工業酶研究領域的重點與熱點課題。全球淀粉處理的酶的市場約為1.5億美圓，其中用于淀粉液化過程的約占24％。因此，對于淀粉酶生產產率，耐熱性以及酶活性的任何提高均具有十分重要的理論意義與直接商業價值。

目前工業上普遍使用的耐熱淀粉酶來自于地衣芽孢桿菌，該酶即地衣芽孢桿菌嗜熱淀粉酶(BLA，如Taka-therm)的最適催化溫度為90℃，最適pH值為7.0-8.0，且需要Ca²⁺來維持其熱穩定。在實際的工業化淀粉加工過程中，需要高于100℃來實現淀粉的液化，淀粉溶液的pH值通常只有4.5左右，另外，Ca²⁺的加入會影響到后續反應的糖化酶的活性，因此BLA并非最適的淀粉酶。S.Jorgensen與G.Dong等各自獨立的從極端嗜熱古菌Pyrococcus?furiosus克隆并得到極端嗜熱α-淀粉酶PFA，研究發現，PFA具有優秀的耐熱特性，其最適溫度為100℃，在100℃環境下數小時不喪失活力。與此同時，PFA的最適pH為5.5-6.0，不需要Ca²⁺仍能保持80％以上的活性。優良的酶學特性使PFA具有良好的應用前景和商業開發價值。

Pyrococcus?furiosus是從海底火山溫泉中的分離得到的絕對厭氧菌，最適生長溫度100℃，很難用作工業生產的菌種。由于Pyrococcus?furiosus本身培養相對較為復雜，這一淀粉酶的大量制備只能通過外源重組表達來實現。沈微等嘗試在大腸桿菌中直接表達或分泌表達，韋宇拓等在酵母中進行分泌表達，但表達量較低，在SDS-PAGE上未能看到表達條帶。Dong等克隆了該基因并在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中表達，也遇到表達量偏低的問題。當表達量升高時，重組PFA主要以不溶性的包涵體形式表達，Dong等采用了低溫誘導，從菌體破碎上清中純化得到重組蛋白以提高重組蛋白質的可溶性表達，但提高非常有限。隨后Beata等采用與intein融合表達的方式，提高了PFA可溶性表達量，但總的表達量仍不高。Linden等認為，由于重組PFA以包涵體形式表達時表達量遠高于可溶性表達，從包涵體中純化該蛋白質是一種效率更高的方法。他們采用甘油抽提的方法，從包涵體中溶解出有酶活的蛋白，并建立了用疏水柱的一步純化方法，簡化了純化步驟。盡管如此，甘油抽提方法只能溶解出部分活性蛋白，仍有大量重組蛋白質留在沉淀中被棄掉。甘油抽提方法除了收率方面的因素以外，在過程放大等方面亦存在問題。

因此，本領域迫切需要提供一種新的簡便高效、低成本、可放大的重組PFA純化方法，為重組PFA的大量制備提供了新的途徑。

發明內容

本發明旨在提供一種重組的嗜熱α-淀粉酶的提純方法。

本發明的另一個目的是提供一種用上述提純方法所獲得的α-淀粉酶及其用途。

在本發明的第一個方面，提供了一種嗜熱α-淀粉酶的制備方法，它包括步驟：

(1)將嗜熱α-淀粉酶的包涵體在70-100℃的溫度下，在pH9-13的堿性溶液中溶解變性，從而獲得嗜熱α-淀粉酶的變性溶液；

(2)將步驟(1)中獲得的嗜熱α-淀粉酶的變性溶液進行復性，從而獲得嗜熱α-淀粉酶的復性溶液；

(3)從步驟(2)得到的嗜熱α-淀粉酶的復性溶液分離出嗜熱α-淀粉酶。

在另一優選例中，所述的嗜熱α-淀粉酶是選自下組的嗜熱α-淀粉酶：火球菌屬的嗜熱α-淀粉酶、嗜熱古菌Pyrococcus?furiosus(也譯為激烈火球菌)的嗜熱α-淀粉酶、沃氏火球菌Pyrococcus?woesei的嗜熱α-淀粉酶以及來源于其他嗜熱微生物的嗜熱α-淀粉酶。

在另一優選例中，所述的嗜熱α-淀粉酶是以下菌種所產生的嗜熱α-淀粉酶：嗜熱古菌Pyrococcus?furiosus?DSM?3638、嗜熱古菌Pyrococcus?furiosus?ATCC43587、Pyrococcus?woesei?ATCC?49860、或其組合。

在另一優選例中，所述的嗜熱α-淀粉酶是嗜熱古菌Pyrococcus?furiosus的嗜熱α-淀粉酶。

在另一優選例中，獲得重組的嗜熱α-淀粉酶包涵體的表達載體為T7啟動子的表達載體。