[發明專利]鹽生杜氏藻3－磷酸甘油脫氫酶同工酶及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 200610021865.1
• 申請日: 2006-09-15
• 公開（公告）號: CN101144089A
• 公開（公告）日: 2008-03-19
• 發明（設計）人: 曹毅;喬代蓉;白林含;徐輝;孫曉菲;黃非;李世林
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/10;C12N15/82;C12P7/20
• 代理公司: 成都科海專利事務有限責任公司
• 代理人: 黃幼陵

技術領域

本發明涉及一種可作為耐鹽農作物培養劑和提高甘油產量的酶及其基因、重組質粒，以及所述酶、基因、重組質粒的制備方法。

背景技術

地球上有許多因鹽堿化而無法有效利用的土地資源，為了有效地利用這些土地資源，人們一直在尋找既適應在鹽堿化土地上生長、又具有較高經濟價的植物品種，然而，迄今為止沒有十分適合的此類植物品種。隨著生物學的發展，通過轉基因方法改良植物品種、使現有的植物具有耐鹽性已成為現實。

甘油是一種重要的化工原料，通過基因工程提高其產量有著顯著的經濟效益。

公開號為CN?1621517A的專利申請公開了一種鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶及其基因，雖然所述酶不僅可培育出耐鹽性的植物，而且可提高甘油的產量，但是就世界范圍而言，鹽堿化土地不少，甘油的需要量較大，因此，開發出更多的能使植物具有耐鹽性的基因及其蛋白、開發出更多的能提高甘油產量的基因及其蛋白有著重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的兼具耐鹽性和提高甘油產量兩種用途的基因及其表達的酶，本發明的再一目的是提供所述基因、酶的制備方法。

本發明的技術方案：

以鹽生杜氏藻(Dunaliella?salina)為原料制備鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因(縮寫為Ds.GPD1)，所述3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因具有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列。鹽生杜氏藻屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、多毛藻科、杜氏藻屬，主要生長在高鹽的水體中。細胞形態通常為卵圓形，當外界滲透壓發生變化時，其形態可變為球形或紡錘形。它具有兩條等長的鞭毛和一個杯狀的葉綠體，在葉綠體的外緣可積累大量的β—胡蘿卜素，使細胞呈橙紅色。細胞無細胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。

3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因的制備方法依次包括以下步驟：

(1)鹽生杜氏藻總RNA的提取與mRNA的分離；

(2)鹽生杜氏藻cDNA文庫的構建；

(3)鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因的全長克隆、測序。

本發明所述3-磷酸甘油脫氫酶同工酶的重組質粒，含有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列，有三種制備方法。第一種制備方法是將所制備的鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因片段克隆至中間載體pBluescript，再通過引入的酶切位點BamH1、Sacl，亞克隆至表達載體pBI121，即形成重組質粒(第一種制備方法所構建的重組質粒在附圖說明和具體實施方式中稱為重組質粒I)。第二種制備方法是將所制備的鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因片段克隆至表達載體pRS426形成重組質粒(第二種制備方法所構建的重組質粒在附圖說明和具體實施方式中稱為重組質粒II)。第三種制備方法是將所制備的鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因片段克隆至表達載體pET32a形成重組質粒(第三種制備方法所構建的重組質粒在附圖說明和具體實施方式中稱為重組質粒III)。

本發明所述鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶是將上述重組質粒進行表達而成，其制備包括以下步驟：

(1)按照前述方法制備鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因；

(2)將重組質粒III將其轉入大腸桿菌中進行原核表達。

(3)通過Ni親和純化柱獲得重組的鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶。

本發明所述鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶具有序列表中SEQ?ID?NO.2所述的氨基酸序列。將上述第一種制備方法制備的重組質粒I轉入根癌農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)EHA105中，用于轉化模式植物(野生型)，則可培育出耐鹽性的轉基因植株。將上述第二種制備方法制備的重組質粒II通過電轉化法轉入模式生物釀酒酵母，則可提高其甘油產量。將上述第三種制備方法制備的重組質粒III轉入大腸桿菌BL21中，則可大量表達純化所述的鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶。

本發明對耐鹽性植物的培育和甘油產量的提高開發了一種新酶，具有明顯的社會效益和經濟效益。

附圖說明

圖1是含有鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因的重組質粒I的一種結構示意圖，中間載體為pBluescript，表達載體為pB1121；

圖2是含有鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因的重組質粒II的一種結構示意圖，載體為pRS426；

圖3是含有鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因的重組質粒III的一種結構示意圖，載體為pET32a。

具體實施方式