[發(fā)明專利]蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4－凋亡素融合蛋白(PTD4－Apoptin)及其制法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610019240.1
• 申請(qǐng)日: 2006-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101081871A
• 公開(kāi)（公告）日: 2007-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 屈伸;孫軍;宗義強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C07K14/005;C12N15/62;C12N15/09;A61K38/16;A61P35/00;A61P1/16
• 代理公司: 武漢開(kāi)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 樊戎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別涉及生物技術(shù)藥物，尤其是用于治療腫瘤的生物技術(shù)藥物。

背景技術(shù)

腫瘤是世界上致人死亡的主要疾病，目前對(duì)腫瘤的治療方法有手術(shù)治療、放療和化療等措施，手術(shù)治療僅對(duì)早期腫瘤有一定療效，對(duì)晚期腫瘤則療效不佳，放療和化療費(fèi)用高、對(duì)人體損傷大，尋找新的安全有效的治療腫瘤的藥物和方法，是當(dāng)前醫(yī)藥領(lǐng)域面臨的重要課題。

來(lái)源于雞貧血病毒(chicken?anemia?virus，CAV)的VP3蛋白(亦稱凋亡素，Apoptin)因其腫瘤特異性凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)而引起了人們的關(guān)注。體內(nèi)外研究結(jié)果均表明，VP3(本文中的VP3均指雞貧血病毒的VP3蛋白，即CAV?VP3)能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡^[1]，其誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)為非p53依賴性^[2]、不受抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL的抑制^[3]。更有意義的是，VP3僅誘導(dǎo)具有致瘤表型細(xì)胞或轉(zhuǎn)化表型細(xì)胞的凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)凋亡效應(yīng)、無(wú)細(xì)胞毒性^[4]，VP3轉(zhuǎn)基因小鼠能正常生長(zhǎng)發(fā)育^[5]，這些特點(diǎn)表明VP3是一種極有應(yīng)用前景的抗腫瘤制劑，人們?yōu)槔肰P3治療腫瘤進(jìn)行了積極的探索。目前，直接導(dǎo)入外源性vp3基因進(jìn)行基因治療仍是人們采取的主要策略；同時(shí)，針對(duì)不同腫瘤嘗試了不同策略以實(shí)現(xiàn)靶向性治療^[6-7]，如我們?cè)趪?guó)際上首次報(bào)道了通過(guò)受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移技術(shù)實(shí)現(xiàn)vp3基因體內(nèi)肝細(xì)胞定向轉(zhuǎn)移和表達(dá)，特異性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，取得了良好的抑瘤效果^[8-9]。但是，如何充分發(fā)揮VP3“腫瘤細(xì)胞特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡”的特性，避免外源基因?qū)塍w內(nèi)后可能出現(xiàn)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，如過(guò)度表達(dá)等，進(jìn)一步擴(kuò)展VP3治療腫瘤的應(yīng)用范圍，仍是亟待解決的問(wèn)題。

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(protein?transduction?technology)是近年來(lái)新興的一種大分子轉(zhuǎn)移技術(shù)，該技術(shù)利用一些具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein?transduction?domain，PTD)(中文簡(jiǎn)稱：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域)的蛋白質(zhì)或多肽，直接將具有治療作用的生物大分子“送”入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)^[10]。這種具有穿過(guò)細(xì)胞膜的能力的多肽稱為細(xì)胞透膜肽(Cell-Penetrating?Peptides，CPPs)，其長(zhǎng)度一般不超過(guò)30個(gè)氨基酸且富含堿性氨基酸，如TAT(11肽、13肽)、Antp(16肽)、VP22(34肽)、Transportan(28肽)、MAP(18肽)。CPP可傳送的物質(zhì)范圍很廣泛，如蛋白質(zhì)、DNA、抗體、顯像試劑、毒素、納米藥物顆粒、脂質(zhì)體等^[11]。CPP傳送系統(tǒng)既是一個(gè)很好的研究細(xì)胞內(nèi)生物過(guò)程的工具，也是一個(gè)在生物藥物傳送方面具有潛在價(jià)值的研究對(duì)象。這一技術(shù)正成為腫瘤生物治療的新思路——利用它可直接將治療物導(dǎo)入癌細(xì)胞，使治療作用更加可控^[10]。

目前相關(guān)研究多集中在HIV-TAT(trans-activator?of?transcription)多肽上。TAT蛋白(86肽)是一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白，1988年Green^[11]和Frankel^[12]各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)HIV-TAT蛋白具有穿透生物膜的能力^[12-13]；隨后發(fā)現(xiàn)這一透膜能力是由47-57(或48-60)氨基酸殘基之間的肽段所介導(dǎo)，而且TAT多肽與其他蛋白形成的融合蛋白也能透過(guò)細(xì)胞膜，并能發(fā)揮這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能^[14-16]。Ho等人^[17]利用化學(xué)合成法對(duì)TAT進(jìn)行改造，通過(guò)氨基酸替換得到了一系列的TAT-PTD多肽，其中PTD4的二級(jí)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高，可使目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)成功率幾乎達(dá)到100％，且單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)導(dǎo)入量是TAT導(dǎo)入量的33倍，但PTD4能否通過(guò)生物合成而實(shí)現(xiàn)融合蛋白的跨膜運(yùn)輸目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種治療腫瘤的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域4-凋亡素融合蛋白(PTD4-Apoptin融合蛋白，或稱PTD4-CAV?VP3融合蛋白)，使其具有良好的穿透生物膜效應(yīng)且能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較大殺傷力、不損傷正常細(xì)胞、不會(huì)有導(dǎo)入外源基因的情況發(fā)生等特點(diǎn)。同時(shí)，本發(fā)明還提供這種治療腫瘤的PTD4-Apoptin融合蛋白的制備方法。