[發明專利]蛋白轉導域4－凋亡素融合蛋白(PTD4－Apoptin)及其制法和應用

無效

• 申請號: 200610019240.1
• 申請日: 2006-05-31
• 公開（公告）號: CN101081871A
• 公開（公告）日: 2007-12-05
• 發明（設計）人: 屈伸;孫軍;宗義強
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/005;C12N15/62;C12N15/09;A61K38/16;A61P35/00;A61P1/16
• 代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司
• 代理人: 樊戎

1.蛋白轉導域4-凋亡素融合蛋白PTD4-Apoptin，具有序列表中序列6或序列7所示的氨基酸序列。

2.表達蛋白轉導域4-凋亡素融合蛋白的基因，具有序列表中序列5所示的核苷酸序列。

3.蛋白轉導域4-凋亡素融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

a.構建含PTD4序列的原核表達載體pET28a-PTD4；

b.構建含PTD4-Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin；

c.PTD4-Apoptin融合蛋白的表達及純化。

4.根據權利要求3所述的制備蛋白轉導域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所說的構建含PTD4序列的原核表達載體pET28a-PTD4的方法是：根據組成PTD4多肽的11個氨基酸序列，按照原核生物密碼子的特點設計編碼PTD4多肽的兩條寡核苷酸堿基序列，合成該兩條寡核苷酸片段，將該兩條寡核苷酸片段等摩爾混合，95℃10min，然后室溫放置1h復性，形成編碼PTD4的雙鏈DNA，將獲得的編碼PTD4的DNA雙鏈插入到原核表達載體pET28a的Nhe?I處。

5.根據權利要求4所述的制備蛋白轉導域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所說的編碼PTD4多肽的兩條寡核苷酸堿基序列具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。

6.根據權利要求3所述的制備蛋白轉導域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所說的構建含PTD4-Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin的方法是：構建含Apoptin基因的真核表達載體pcDNA-Apoptin，以5′端分別含有限制性內切酶EcoR?I和Xho?I識別位點的兩條PCR引物5′-AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′和5′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′進行PCR擴增反應，擴增雞貧血病毒的Apoptin基因，反應條件為循環參數為94℃5min，94℃55sec、60℃50sec、72℃55sec，循環擴增30次，72℃保溫10min；將PCR擴增片段Apoptin和pET28a-PTD4重組質粒分別經EcoR?I和Sal?I雙酶切，回收目的片段，連接、轉化DH5α，擴增提取質粒pET28a-PTD4-Apoptin。

7.根據權利要求3所述的制備蛋白轉導域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所說的PTD4-Apoptin融合蛋白的表達及純化的方法是：將純化后的重組質粒pET28a-PTD4-Apoptin轉化表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培養基中37℃震蕩培養，到A₆₀₀＝0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度1.0mM誘導8小時，超聲破菌，離心收集包涵體，以未誘導菌作對照，經12.5％SDS-PAGE鑒定；將包涵體溶于含8mol/l尿素的上樣緩沖液中，經鎳親和層析柱純化，SDS-PAGE鑒定洗脫蛋白，合并含目的蛋白的洗脫液，透析、濃縮、過濾除菌，BCA法測定蛋白含量，-80℃保存。

8.含PTD4和Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin。

9.權利要求1所述的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。

10.權利要求1所述的融合蛋白在制備用于治療肝癌的藥物中的應用。