[發(fā)明專利]基于納米金屬顆粒的長片段核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610015470.0
• 申請日: 2006-08-28
• 公開（公告）號: CN101134973A
• 公開（公告）日: 2008-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張治洲;汪名春;王群;曹小紅
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 王來佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學技術(shù)領(lǐng)域的一種聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增的方法，特別是高濃度納米金屬試劑用于長片段聚合酶鏈式反應(yīng)(Long-PCR)擴增的優(yōu)化方法。

背景技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，又稱體外酶促基因擴增，是一種在體外模擬DNA體內(nèi)復制的基因擴增技術(shù)，該技術(shù)由K.Mullis于1985年發(fā)明，能在耐熱DNA聚合酶的作用及特異性引物的引導下，在很短的時間里就能在一個試管內(nèi)實現(xiàn)只有在生物體細胞分裂增殖時才出現(xiàn)的基因的大量復制，一般來說，在數(shù)小時內(nèi)就可以將目的基因擴增至百萬倍。

在過去的20多年的時間里，PCR技術(shù)在不斷進步和發(fā)展，在此過程中，一系列PCR方法被建立和設(shè)計出來，并廣泛應(yīng)用于整個生命科學領(lǐng)域的研究中。長片段聚合酶鏈式反應(yīng)(Long-PCR)擴增法作為其中的一種，它是由Barnes等人在1994年首先實踐成功35kb長片段DNA的擴增，不久Roche公司的Cheng等用相似的方法以lambdaDNA為模板擴增出42kb的片段和以人基因組DNA為模板擴增出22kb的片段，由此也就真正形成了一套長片段PCR的技術(shù)方法。和常規(guī)PCR相比，Long-PCR能有效地擴增出大于10kb以上的DNA片段，因此在長片段DNA克隆、基因組研究及基因突變和基因表達的檢測等方面得到了越來越多地應(yīng)用。顯而易見，Long-PCR方法的產(chǎn)生大大拓寬了PCR技術(shù)在生命科學各領(lǐng)域的應(yīng)用。

Long-PCR方法自建立以來，在不斷完善中逐漸成熟，形成了一套較為完整的技術(shù)體系，但是在實際應(yīng)用中還存在不少缺點，如擴增的特異性不高，擴增效率低，復雜模板擴增困難等，而最常見的是Long-PCR擴增失效。這些雖然和引物的設(shè)計優(yōu)劣有很大的關(guān)系，但在很大程度上也依賴于反應(yīng)體系的組合調(diào)整和反應(yīng)條件的優(yōu)化。在多年的研究中，我們已經(jīng)掌握了不少對Long-PCR反應(yīng)有優(yōu)化效果的PCR添加劑，如DMSO，甘油，Tween，NP-40，SSB，甲酰胺等，它們都在不同程度和方式上促進Long-PCR的擴增，但總的來說，它們的優(yōu)化效果不很理想，有些對酶的活力有抑制作用。雖然在產(chǎn)品競爭的過程中，世界著名的各大生物試劑公司都研發(fā)出了適用不同長度，不同模板的長片段擴增試劑盒，大大方便了我們擴增長片段的需要，但是這些試劑盒也具有不可避免的缺點：價格昂貴和擴增有效性不可知，而這對于Long-PCR方法的進一步擴大應(yīng)用無疑是很大的限制。

我們通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在2005年9月的《德國應(yīng)用化學》上，一篇由上海交通大學李海闊等人撰寫的《納米PCR》文章中首次報道了應(yīng)用膠體金作為PCR優(yōu)化劑的研究，他們指出在0.01％膠體金添加量不超過1.5uL時對普通25uLPCR有促進作用，即有效提高反應(yīng)得特異性，避免擴增失效，但超過1.5uL則對整個反應(yīng)有抑制作用，產(chǎn)量降低甚至無產(chǎn)物出現(xiàn)。至此，膠體金作為一種新型和高效的PCR優(yōu)化劑逐漸被越來越多的人所認識，而對其進行更多更細致的應(yīng)用研究將會給PCR技術(shù)帶來新的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于納米金屬顆粒的長片段核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法，該方法是通過在現(xiàn)有的Long-PCR體系中加入高濃度膠體金屬溶液，在普通Taq酶以及Pfu酶的聯(lián)合作用下達到對長度為10kb以上DNA片段的有效擴增。此優(yōu)化方法操作簡單，優(yōu)化效果顯著，特別是基于普通的Taq酶和Pfu酶所進行的擴增，其成本較低，應(yīng)用更加廣泛。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

基于納米金屬顆粒的長片段核酸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的優(yōu)化方法，其方法是：

(1)單質(zhì)納米金屬膠體溶液的準備；

(2)單質(zhì)納米金屬膠體溶液的滅菌；

(3)PCR體系的配置；

(4)PCR體系的優(yōu)化；

(5)PCR條件的設(shè)定與運行；

(6)PCR產(chǎn)物檢測：對擴增好的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢查擴增片段在凝膠中的位置，并與相應(yīng)的分子量標準做對照。

而且，所述的PCR體系的優(yōu)化是在long-PCR擴增反應(yīng)體系中添加其體積比為10～20％的含量為0.01％的單質(zhì)納米金屬膠體溶液。

而且，所述的單質(zhì)納米金屬膠體溶液是指：納米金屬顆粒直徑0.2～100nm、含量為0.01％的單質(zhì)納米金屬膠體溶液，對于含量大于0.01％的單質(zhì)納米金屬膠體溶液，稀釋為0.01％后使用；對于含量小于0.01％的單質(zhì)納米金屬膠體溶液，直接使用，但添加的量應(yīng)通過換算后得到。