[發(fā)明專利]使用自我保護(hù)寡核苷酸調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200580048308.2
• 申請日: 2005-12-30
• 公開（公告）號: CN101124339A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 托德·M·豪澤;阿龍·盧米斯
• 申請（專利權(quán)）人: 托德·M·豪澤;阿龍·盧米斯
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07H21/02;C12P19/34;C07H21/04;C12N15/63;A01N43/04
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 李瑛

發(fā)明背景

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般地涉及自我保護(hù)多核苷酸，和使用它們調(diào)節(jié)基因表達(dá)和治療疾病的方法。

相關(guān)技術(shù)的描述

基因沉默或抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象蘊(yùn)含著治療和診斷目的，以及研究基因功能本身的重大希望。這種現(xiàn)象的實(shí)例包括反義技術(shù)和轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。

近年來用于基因沉默的反義策略引起了極大關(guān)注。其基礎(chǔ)概念很簡單，原則上也很有效：含靶RNA的反義核酸(NA)堿基對導(dǎo)致失活。反義RNA或DNA對靶RNA的識別可以認(rèn)為是一種雜交反應(yīng)。因?yàn)橥ㄟ^序列互補(bǔ)性結(jié)合該靶，這暗示反義NA的適當(dāng)選擇應(yīng)確保高度特異性。靶RNA的失活可以通過不同的途徑發(fā)生，這取決于反義NA(修飾或未修飾的DNA或RNA)的性質(zhì)，和其中將要發(fā)生抑制的生物系統(tǒng)的性質(zhì)。

然而，許多問題繼續(xù)存在于有效反義和PTGS技術(shù)的發(fā)展中。例如，DNA反義寡核苷酸僅顯示出短期有效性，并且所需劑量通常有毒性；類似地，由于穩(wěn)定性問題，反義RNA的應(yīng)用也已證明是無效的。已經(jīng)利用各種方法嘗試了通過降低核酸酶靈敏性來提高反義穩(wěn)定性。這些方法包括修飾正常的磷酸二酯主鏈，例如使用硫代磷酸酯或甲基膦酸酯；摻入2′-OMe-核苷酸，使用肽核酸(PNA)和使用3′-末端帽，如3′-氨丙基修飾或3′-3′-末端鍵。然而，這些方法昂貴而且需要額外的步驟。此外，非天然存在的核苷酸和修飾的使用妨礙了體內(nèi)表達(dá)反義序列的能力，由此需要合成它們和之后給予。

因此，仍需要在體外和體內(nèi)靶向、定向抑制基因功能的有效和持久的方法和組合物，尤其是在高等脊椎動物細(xì)胞中，包括穩(wěn)定性增加的改善的反義RNA。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了新的組合物和方法，其包括對調(diào)節(jié)基因表達(dá)有用的自我保護(hù)寡核苷酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括分離的自我保護(hù)多核苷酸，包含具有與靶mRNA序列互補(bǔ)的序列的區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)。在特定實(shí)施方案中，該寡核苷酸包含兩個(gè)或多個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)。該自身互補(bǔ)區(qū)可以位于多核苷酸的5′末端、3′末端或兩個(gè)末端。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸包括RNA、DNA或肽核酸。

在另外的實(shí)施方案中，自我保護(hù)多核苷酸進(jìn)一步包含第二序列，其與靶mRNA序列非互補(bǔ)或部分互補(bǔ)，和與自身互補(bǔ)區(qū)非互補(bǔ)，并且所述第二序列位于自身互補(bǔ)區(qū)和與靶mRNA序列互補(bǔ)的序列之間。

在特定實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)包含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。

在相關(guān)實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)不與和靶mRNA序列互補(bǔ)的序列互補(bǔ)。

在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，其中多核苷酸包含兩個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)，這兩個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)彼此不互補(bǔ)。

在特定實(shí)施方案中，與靶mRNA序列互補(bǔ)的序列包含至少1?7個(gè)核苷酸，或17至30個(gè)核苷酸。

在其他實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)包含至少5個(gè)核苷酸、至少12個(gè)核苷酸、至少24個(gè)核苷酸或12至48個(gè)核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)包含至少1個(gè)核苷酸。在其他實(shí)施方案中，該環(huán)區(qū)包含至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少6個(gè)核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含多重本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸的陣列。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括能夠表達(dá)本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸的表達(dá)載體。在不同的實(shí)施方案中，該表達(dá)載體是組成型或誘導(dǎo)型載體。

本發(fā)明進(jìn)一步包括組合物，其包含生理學(xué)可接受的載體和本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸。

在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種降低基因表達(dá)的方法，包括將本發(fā)明的自我保護(hù)寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。在不同的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是植物、動物、原生動物、病毒、細(xì)菌或真菌的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，該多核苷酸被直接導(dǎo)入細(xì)胞，而在其他實(shí)施方案中，該多核苷酸通過足以將分離的多核苷酸遞送入細(xì)胞的手段細(xì)胞外導(dǎo)入細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種治療疾病的方法，包括將本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，其中靶基因的過量表達(dá)與該疾病相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疾病是癌癥。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種治療患者的感染的方法，包括將本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入患者，其中分離的多核苷酸介導(dǎo)感染物的進(jìn)入、復(fù)制、整合、傳染或維持。

在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定基因功能的方法，包括將本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，其中該多核苷酸抑制該基因表達(dá)，和測定該多核苷酸的導(dǎo)入對細(xì)胞特征的影響，由此確定靶基因的功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用高流通量篩選實(shí)施該方法。