[發明專利]減少含有目的維生素K依賴性蛋白質的組合物中的蛋白質污染物的含量

有效

• 申請號: 200580046486.1
• 申請日: 2005-12-23
• 公開（公告）號: CN101098883A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發明（設計）人: J·克拉魯普;T·B·漢森;A·C·阿倫岑;D·E·拉斯馬森;A·博格辛斯;A·斯塔比;H·阿曼迪安;S·班
• 申請（專利權）人: 諾和諾德醫療保健公司
• 主分類號: C07K1/16
• 分類號: C07K1/16;C07K14/745
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 胡國群

發明領域

本發明涉及具有非常低的，或者可以忽略的蛋白質污染物含量的維生素K依賴性蛋白質組合物。本發明還涉及可應用于制備這樣的維生素K依賴性蛋白質組合物的方法。這樣的方法可以單獨或相繼組合使用，以減少蛋白質污染物的相對含量。本發明特別涉及凝血因子的組合物的制備，所述凝血因子選自凝血因子X多肽(FX/FXa)、凝血因子IX多肽(FIX/FIXa)、凝血因子VII多肽(FVII/FVIIa)和抗凝蛋白C，特別是凝血因子VII多肽。?

發明背景?

在從微生物或細胞系的培養來生產重組蛋白的過程中，最后的生產步驟是回收和任選地濃縮目的產物。其中已經生長了細胞并且含有分泌的蛋白質和特別是細胞溶解產物(包含細胞內的目的蛋白)的培養基，除了其他污染物(例如培養基成分、核酸等)以外，或多或少還含有由細胞產生的其他蛋白質。為了獲得純化的蛋白質產物，因而需要將目的蛋白與含有該目的蛋白的粗制材料中的其他蛋白質和多肽以及其他雜質分離開。?

除去包含具有與目的多肽相同的性質的結構域的蛋白質污染物通常是困難的。?

維生素K依賴性蛋白質通過在它們的分子氨基末端部分中所共有的共同結構特征而與其他蛋白質相區別。這些蛋白質的N-末端，也稱為Gla-結構域，富含稀有氨基酸γ-羧基谷氨酸，該氨基酸在由γ-谷氨?酰羧化酶催化的維生素K依賴性反應中從谷氨酸合成。由于存在大約2-12個Gla殘基，Gla-結構域的特征是能夠結合二價陽離子例如Ca²⁺。一旦結合金屬離子，這些蛋白質發生能夠通過多種技術(例如圓二色性和熒光發射)測量的構象變化。?

含Gla的蛋白質的金屬誘導的構象變化的發現(Nelsestuen等人，J.Biol.Chem.1976；251，6886-6893)以及構象特異性多克隆抗體的鑒定(Furie等人，J.Biol.Chem.1978；253，8980-8987)為引入構象特異性免疫親和層析打開了通道。這些抗體在Ca²⁺離子存在的情況下能夠識別并結合Gla-結構域，但是一旦用Ca²⁺螯合劑(例如EDTA或檸檬酸鹽)除去Ca²⁺離子后就會釋放出該蛋白質。?

在20世紀80年代，利用含Gla的蛋白質發生金屬誘導的構象變化的獨特性質而開發了構象特異性擬親和層析(pseudoaffinitychromatography)。擬親和層析由于沒有固定化的親和配體參與而不同于常規的親和層析，而且它在常規的層析基質上進行(Yan?S.B.，J.Mol.Recog.1996；9，211-218)。通過除去二價金屬離子能夠將Gla蛋白質吸附至陰離子交換材料上。隨后，通過加入Ca²⁺至洗脫緩沖液中來進行洗脫。?

在1986年，?和Thim報導了利用凝血因子VII的Gla-結構域的Ca²⁺結合特性在陰離子交換材料上對重組凝血因子VII進行純化(?S.和Thim?L.，Research?Dislosure，1986，26960-26962.)。吸附在沒有Ca²⁺的緩沖液中進行，并且用低離子強度的含Ca²⁺緩沖液和在溫和條件下可以洗脫出凝血因子VII。?

Yan等人已經用相同原理純化了重組人蛋白C(Yan?S.B.等人，Bio/technology.1990；8，655-661)。?

雖然Gla-結構域的存在為分離含Gla的蛋白質與其他蛋白質提供了有利條件，但是本發明的發明人觀察到，含Gla的蛋白質的類似特性和行為使得難以將它們彼此分離。針對一種Gla蛋白質的幾種構象特異性抗體顯示出與其他Gla蛋白質的交叉反應性(Furie?B.和FurieB.，J.Biol.Chem.1979；254，9766-9771；Church等人，J.Biol.?Chem.1988；263，6259-6267)。?

Brown等人(Brown等人，J.Biol.Chem.2000；275，19795-19802)已經報導了對于Gla殘基特異的單克隆抗體。這些抗體可以識別所有經測試的Gla蛋白質：凝血因子VII、凝血因子IX、凝血因子II、蛋白C、蛋白S、GAS-6、骨基質Gla蛋白質、芋螺抑制肽G。?