[發明專利]多肽鏈多亞基蛋白質的復合表達

無效

• 申請號: 200580045813.1
• 申請日: 2005-10-11
• 公開（公告）號: CN101120092A
• 公開（公告）日: 2008-02-06
• 發明（設計）人: 馬延高;馬向東
• 申請（專利權）人: 基諾藥業有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/17;C12N15/63;C12N15/64;C12N5/10;C07H21/04;C12P21/00;C12P21/02;C12P21/04;A61K47/06;A61K38/28;A61K38/19;A61K38/16
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 章社杲;李丙林

已申請的相關專利

本專利要求對于2004年11月3日申報的，專利申請號為200410061039.0的中國專利申請的全部以及相關的內容具有優先權益。

技術領域

這項發明是一項有關應用重組DNA技術生產蛋白質的過程工藝以及相關的結構和系統。這項發明應用宿主細胞分別而又同時復合表達出目標蛋白的兩個及兩個以上的多肽鏈，亞基或其他的類似物，譬如人胰島素，通過單一的重組載體進行表達。經過篩選的宿主細胞正如設計所要求地分泌出具有活性的蛋白質。這項發明具有多方面應用的先進性，尤其在大規模藥物工業化生產方面。

背景技術

生產蛋白質藥物，把優化基于基因重組技術基礎上的生物制藥過程看作是有效控制成本的關鍵。歸根結底，生產的步驟和原料的制備過程越少越好。現存的生物技術產業的生產過程通常為以下問題所困擾：首先是在獲得終產物之前的中間步驟太多；其次是生產中用到的生物所產生的中間體或終產物的生命周期不易控制，所以導致了產率的降低；第三，這種中間體或是終產物總是需要昂貴的并且多次的純化步驟。

近來，一種工業生產多肽鏈或多亞基蛋白質的方法是將它們分別生產，然后純化，修飾并且在體外合成終產物。在終產物中的多肽鏈或多亞基在體外合成時必須按照一定的比例和正確的形態組裝，才能形成天然的具有生物活性的結構。這種正確的形態包括在多肽鏈或亞基的氨基酸殘基上的正確的氧化還原狀態以便形成交聯所需的并使蛋白質得以穩定的二硫鍵。在這種條件下多肽鏈或亞基之間的不正確的比例導致了終產物的不溶或失活，以及產率和質量的嚴重下跌。

另一種方法是將在多肽鏈或亞基如同一條線狀多肽制造出來，無論它有沒有二硫鍵。這種方法的好處是解決了上面所說的多肽鏈或亞基之間的不正確的比例的問題；但是在多肽鏈或亞基能夠正確地合成終產物之前必須增加一個斷鏈的步驟。這種化學的或酶解的斷鏈的步驟，以及后續的修飾步驟同樣是費時費錢。

以胰島素為例，一個穩定的具有生物活性的胰島素分子是由兩條稱為A鏈和B鏈的多肽組成的。以人的胰島素為代表的胰島素分子具有一個21個氨基酸的A鏈和一個30個氨基酸的B鏈。它們彼此通過兩個二硫鍵連接，另有第三個二硫鍵在A鏈內部(G.Bell，etal.1979Nature?282：525-527)。自然狀態下的胰島素分子的兩條鏈是由一條單鏈mRNA編碼，并翻譯為一條多肽。然后再酶解斷鏈成為兩條多肽鏈。因此胰島素分子的A，B鏈與其它的某些大分子的亞基不同，它原本是一條線狀多肽，只是在翻譯后才經過斷鏈而分開的。下面在有關胰島素的制造工藝上對上述的兩種方法還要作進一步的描述。

另一個與胰島素這類多肽鏈不同的具有亞基的多肽的例子是白介素-12(IL-12)。白介素-12是由兩個多肽亞基組成的(p35和p40)，但是這兩個亞基分別代表著兩個完全不同而且不相關的基因，3p12-3q13.2(p35)和5q31-q33(p40)的表達產物，而且分別由多個二硫鍵連接(Gubler?U.et?al.1991Co-Expression?Of?Two?DistinctGenes?Is?Required?To?Generate?Secreted?Bioactive?CatatonicLymphocyte?Maturation?Factor.Proc.Natl.Acad.Sec.USA，88：4143-47).

作為具有多肽鏈或亞基的藥用多肽在其大規模生產時也總是面臨以上問題。因此迫切需要發展一種簡單而又高效的生產工藝用以明顯地減少表達后修飾，純化，酶切，與此同時達到高產率高質量的產品，無論它的多肽和亞基的構成如何。胰島素產業就是一個很好的例子。

眾所周知，胰島素是由胰腺的朗格罕小體中的beta細胞分泌的，唯一具有降糖功能的天然激素，治療糖尿病的特效藥。糖尿病導致一系列嚴重的并發癥。在美國有一千八百二十萬患者，占人口6.3％。在中國有三千萬患者。由于胰島素的絕對或相對缺失所造成的葡萄糖使用度低下，使得患者并發高血壓，高血糖，嚴重的動脈粥樣硬化，及神經系統，腎臟和微循環疾病。是美國第七位致死的疾病。它也是20-74歲人群中導致失明和腎衰的首要病因。不僅如此，糖尿病患者還面臨著壞疽截肢，心血管疾病，和休克的高發風險。