[發明專利]生產具有靶向基因組修飾的卵母細胞或卵的體外方法

無效

• 申請號: 200580043072.3
• 申請日: 2005-12-19
• 公開（公告）號: CN101175858A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: J－S·若利;V·瑟姆斯;F·索姆
• 申請（專利權）人: 國立農業研究所－INRA
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/63
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

本發明涉及在卵母細胞或卵中引入靶向基因組修飾(modificationgénomique?ciblée)的體外方法以及在宿主細胞基因組中進行隨機插入的方法。

轉基因是一種分子遺傳學技術，采用這種技術將外源DNA引入到多細胞生物的基因組中，并傳遞給其后代。這種傳遞給后代使所述DNA穩定整合在該胚胎的基因組中，并且在發育早熟期(stade?précoce)也如此。

目前，采用最多的其中一種轉基因技術是在哺乳動物卵中微量注射裸DNA的技術，該技術在許多情況下導致一部分微量注射的DNA分子整合在該卵基因組中。一些其它技術可用于轉基因，特別是在活細胞中引入外源DNA的技術，這些技術是本領域技術人員熟知的，具體地是電穿孔，借助磷酸鈣沉淀、脂質體或修飾脂質例如(INVITROGEN)的轉染。

在外源DNA靶向整合在基因組中的情況中，需要利用同源重組機制。在這種情況下，外源DNA應該具有與在該基因組中靶向整合位點存在的核酸序列同源的核酸序列。因此這些同源重組機制在大多數生物體內是在極低的頻率下進行的。最近，使用在″內含子歸巢″機制中酵母內所涉及的核酸內切酶(它們屬于″大范圍核酸酶(méganucléase)″家族)允許在細胞培養中，尤其在哺乳動物胚胎干細胞中大大提高這些同源重組的頻率(COHEN-TANNOUDJI等人，Mol.Cell.Biol.，vol.18(3)，第1444-1448頁，1998)。在這些細胞中，誘導外源大范圍核酸酶的表達引起在大尺寸特異核酸序列(大范圍核酸酶I-SceI的18個堿基對)處基因組DNA雙鏈斷開，接著在外源DNA分子序列與圍繞這個斷開位點的同源序列之間發生同源重組。因此，這些大范圍核酸酶能夠使該基因組DNA中的感興趣的序列置換或缺失，或把外源序列引入到該基因組DNA中，并且以″靶向(ciblée)″方式引入。

令人驚奇地，本發明人已證明，在卵中引入外源核酸序列和大范圍核酸酶I-SceI時，應在其基因組中有一個被與外源核酸序列同源的序列圍繞的I-SceI位點，以得到具有靶向基因組修飾的卵，這種修飾相應于在基因組I-SceI位點通過同源重組插入外源核酸序列。

本發明人的發現能夠證明，如果在體內可以實施用大范圍核酸酶的同源重組機制，所述機制也可以足夠的效率直接在卵母細胞或卵中進行，不影響所述生物體發育的程序進行時也如此。因此，本發明的方法能夠得到具有靶向基因組修飾的卵或卵母細胞，并且可能直接得到遺傳修飾的成熟生物，它具有一個這樣的靶向基因組修飾，并且其全部細胞都如此。所述靶向基因組修飾這時可能相應于缺失或插入，特別地插入與野生序列相比突變的序列。

卵或卵母細胞的細胞與正常細胞相比含有大量的細胞質，這樣使得難以進入含有遺傳物質的核中。另外，特別是用于保護卵的卵周圍的膜(卵黃膜)和絨毛膜的存在制約進入該細胞。這些障礙物一般需要采用特別的技術，如直接注射細胞。可采用技術的復雜性制約了可能通過實驗在幾百個卵中進行處理的卵數量。

在卵或卵母細胞中靶向基因組修飾方法的可行性因此需要誘導靶向基因組修飾進行的頻率足以使本領域技術人員能夠在實施這樣一種方法時有獲得成功的合理期望。

顯然，這樣一種合理的成功期望在采用本發明的方法之前是不存在的。事實上，沒有大范圍核酸酶時，同源重組機制在卵中是一種非常稀少的遺傳過程。這樣一種同源重組頻率很可能低于或等于在胚胎干細胞中觀察的同源重組頻率，即每百萬細胞約一次事件。使用提高同源重組頻率的大范圍核酸酶，特別是在胚胎干細胞中(ES；COHEN-TANNOUDJI等人，1998，同前)，不再能使本領域技術人員實現合理的成功期望。事實上，即使在這種情況下提高同源重組頻率，該頻率至多達到頻率6×10^-6，這非常明顯地使所述技術不可用于卵。