[發明專利]生產具有靶向基因組修飾的卵母細胞或卵的體外方法

無效

• 申請號: 200580043072.3
• 申請日: 2005-12-19
• 公開（公告）號: CN101175858A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: J－S·若利;V·瑟姆斯;F·索姆
• 申請（專利權）人: 國立農業研究所－INRA
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/63
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

1.生產具有靶向基因組修飾的非人脊椎動物卵母細胞或卵的體外方法，該方法包括如下步驟：

a)在卵母細胞或卵的核中表達核酸內切酶，其特征在于以外源方式引入所述核酸內切酶，其特征還在于所述卵或卵母細胞的基因組DNA具有至少一個所述核酸內切酶的識別位點，該識別位點相應于至少12個堿基對的特異序列，因此允許：

(i)該核酸內切酶特異序列固定在所述的識別位點；

(ii)在所述的識別位點或在其鄰近區，優選地所述鄰近區在所述

識別位點的100個堿基對以內，通過所述核酸內切酶連續誘發

該基因組DNA雙鏈斷開，然后

(iii)通過同源重組機制修復所述的雙鏈斷開；以及

b)鑒定具有所需靶向基因組修飾的卵或卵母細胞。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在該基因組DNA中存在的所述識別位點通過轉基因引入。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述核酸內切酶是大范圍核酸酶。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于該大范圍核酸酶選自I-CeuI、I-CreI、I-ChuI、I-CsmI、I-DmoI、I-PanI、I-SceI、I-ScEII、1-SceIII、1-SceIV、F-SceI、F-SceII、PI-AaeI、PI-ApeI、PI-CeuI、Pl-CirI、PI-CtrI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MflI、PI-MgoI、PI-MjaI、PI-MkaI、PI-MleI、PI-MtuI、PI-MtuHI、PI-PabIII、PI-PfuI、PI-PhoI、PI-PkoI、PI-PSpI、PI-RmaI、PI-SceI、PI-SspI、PI-TfuI、PI-TliI、PI-TliII、PI-tspI、PI-TspII、PI-BspI、PI-Mchl、PI-MfaI、PI-MgaI、PI-MgaII、PI-MinI、PI-MmaI、PI-MshI、PI-MsmII、PI-MthI、PI-TagI、PI-ThyII、I-NcrI、I-NcrII、I-PanII、I-TevI、I-PopI、I-DirI、I-HmuI、I-HmuII、I-TevII、I-TevIII、F-SceI、F-SceII(HO)、F-SuvI、F-TevI和F-TevII或由它們衍生的大范圍核酸酶。

5.根據權利要求1-4中任一項權利要求所述的方法，其特征在于每個卵或卵母細胞以外源方式并以蛋白形式引入的所述核酸內切酶的濃度是每微升0.1-5單位，優選地每微升0.5-2.5單位。

6.根據上述權利要求中任一項權利要求所述的方法，其特征在于在斷開位點的靶向基因組修飾相應于缺失或插入。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于該方法還包括在卵母細胞或卵中引入外源核酸序列的步驟，該外源核酸序列與位于該基因組DNA中核酸內切酶識別位點上下游的核酸序列具有同源性。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于該引入的外源核酸序列沒有任何所述核酸內切酶的識別位點。

9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于給予每個卵或卵母細胞的核酸序列的濃度是1-50ng/μl，優選地5-40ng/μl。

10.根據權利要求7-9中任一項權利要求所述的方法，其特征在于所述外源核酸序列包括被兩個不同的核酸序列圍繞的感興趣的序列，這些不同的序列與分別位于該基因組DNA中核酸內切酶的識別位點上游和下游的核酸序列具有同源性。

11.根據上述權利要求中任一項權利要求所述的方法，其特征在于非人脊椎動物卵或卵母細胞是哺乳動物、爬行動物、兩棲動物、禽類、昆蟲或魚類的卵或卵母細胞。

12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于非人脊椎動物的卵或卵母細胞是選自鮭魚、鱒魚、金槍魚、庸鰈、鯰魚、斑馬魚、青鳉魚、鯉魚、刺魚、astyanax、羅非魚、金魚、狼鱸、鱘魚和鱈魚的卵或卵母細胞。

13.根據上述權利要求中任一項權利要求所述的方法，其特征在于該方法還包括在適合于能使非人脊椎動物發育的條件下培養具有靶向基因組修飾的預先受精的卵母細胞或卵的步驟。