[發明專利]培養哺乳動物味細胞的方法

無效

• 申請號: 200580040235.2
• 申請日: 2005-10-13
• 公開（公告）號: CN101065479A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: N·E·羅森;M·H·厄茲代內爾
• 申請（專利權）人: 蒙奈爾化學感覺中心
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李瑛

相關申請的交叉引用

本申請要求2004年10月15日提交的美國臨時申請系列No.60/636,377的權益，在此以其整體引入作為參考。

發明領域

本發明涉及哺乳動物味細胞的分離和長期細胞培養的方法。哺乳動物味細胞包括應答味覺刺激物或呈味物質(tastant)的哺乳動物味覺感受器表達細胞。本發明的方法使得對味覺感受器細胞的研究持續延長的一段時間，例如長達三個月或更長時間。此外，本發明的方法與已知方法相比較降低了需要從其分離味細胞的動物數量。由于本發明的方法允許味細胞在體外增殖和分化，使得包括增殖和分化的味細胞過程的體外研究，例如這些過程所需要的營養因子的測定成為可能。將味細胞培養一段延長的時間的能力使得能夠進行需要較長時間范圍的實驗。

背景

味蕾由大約50-100個味細胞組成，味細胞包括呈現神經元和表皮特性的三種形態類型。基于免疫細胞化學特征，可以將這些味細胞分類為I型(暗)、II型(亮)和III型(居中)(Yee等，J?Comp?Neurol.2001年11月5日；440(1)：97-108；Takeda等，J?Comp?Neurol.2004年11月1日；479(1)：94-102)。

研究表明這些味細胞中的大約10％呈現出對神經細胞粘附分子(NCAM)的免疫反應性。雖然NCAM-免疫反應性細胞是III型細胞，但不是所有的III型味細胞對NCAM是免疫反應性的(Nelson和Finger1993，J?Comp?Neurol?336(4)：507-16)，且味細胞中的NCAM表達依賴于IX神經的神經支配(Smith等，1994，J?Comp?Neurol?347(2)：187-96)。這些和其他數據表明了NCAM表達味細胞與神經相聯系。

相反，對味覺刺激物的功能性應答所需要的關鍵分子不在NCAM免疫反應性細胞中表達。例如，味轉導素，是一種參與味覺傳導的關鍵性G-蛋白并且只存在于II型細胞中。然而，沒有在NCAM表達細胞中檢測到味轉導素(Takeda等，1992，J.Electron?Microsc.41(5)：375-80；Yang等，2000，J.Comp?Neurol?425(1)：139-51)。

認為味細胞源自上皮細胞譜系，具有10天的有限平均壽命，其中垂死細胞由基細胞群替代。報道了大部分的味細胞的原代細胞培養物最多持續數天，例如，最多3至5天(比較，例如，對于小鼠味細胞，改良自哺乳動物中樞神經元分離的方法，Spielman等，1989，BrainResearch?503：326-29；而對于大鼠味細胞，Kishi等，2001，Neuroscience?106(1)：217-25，和Stone等，2002，Chem.Senses27：779-87)。

為了能夠檢測給定的呈味物質，味細胞通常需要呈味物質(例如，苦味、甜味、鮮味(umami))的相關味覺感受器和味覺傳導所必需的分子二者。味覺感受器可以包括一種或多種T2R和/或一種或多種T1R。信號傳導分子可以包括味轉導素和磷脂酶C。在此將表達至少一種味覺感受器并能夠應答至少一種味覺刺激物/呈味物質的細胞稱為“味覺感受器細胞”。因此，味細胞在其他細胞類型中包括味覺感受器細胞。

迄今為止，不存在味覺感受器細胞的細胞培養物模型，且任何體外研究都必須依賴于維持有限時間的味細胞的原代細胞培養物。

Ookura等(2002，In?Vitro?Cell.Dev.Biol.-Animal?38：365-72)描述了從小鼠味覺上皮分離的特定類型的細胞，這些細胞已經基于它們的整聯蛋白β1標記得到了分選并表達NCAM標記。因此，這種整聯蛋白陽性連續小鼠細胞培養沒有產生與那些負責味覺刺激物初級檢測的細胞相似的細胞。