[發(fā)明專(zhuān)利]在酮酸存在下的酶促反應(yīng)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200580040163.1
• 申請(qǐng)日: 2005-11-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101065493A
• 公開(kāi)（公告）日: 2007-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A·P·康薩爾沃;N·M·梅塔;W·斯特恩;J·P·吉利甘
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 尤尼基因?qū)嶒?yàn)室公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12P13/02
• 分類(lèi)號(hào): C12P13/02;C12P21/06
• 代理公司: 中國(guó)專(zhuān)利代理(香港)有限公司
• 代理人: 權(quán)陸軍;李連濤

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在特定的反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下X-Gly至X-α -羥基-Gly或X-NH₂(X是具有甘氨酸基團(tuán)可以與其共價(jià)附著的 羰基的肽或任何化合物)的酶促轉(zhuǎn)化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這些反應(yīng) 增強(qiáng)化合物是酮酸(或其鹽或酯)，它們可以有利地替代過(guò)氧化氫酶 使用，所述過(guò)氧化氫酶是現(xiàn)有技術(shù)這些類(lèi)型酶促反應(yīng)，例如酰胺化反 應(yīng)的一般組分。

相關(guān)領(lǐng)域的描述

眾多人激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)衍生的脂肪酸和其 他重要的生物學(xué)化合物具有氨基酸或肽作為其分子結(jié)構(gòu)的基本部 分。許多疾病對(duì)患者中的這些生物學(xué)化合物的水平升高呈陽(yáng)性應(yīng)答。 可以以多種方式給患者施用治療上有效量的此類(lèi)生物學(xué)相關(guān)化合 物。因此，關(guān)于此類(lèi)化合物的有效的、劃算的制造方法是非常重要的。 當(dāng)生物學(xué)化合物以適合于經(jīng)口遞送的劑量形式制備時(shí)，這是特別正確 的，所述經(jīng)口遞送的劑量形式是通常優(yōu)選的施用方式，盡管相對(duì)于其 他施用方式生物利用率較低。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞和其他真核生物可以執(zhí)行特定的翻譯后加工操 作，而原核生物則不能。某些原核生物，例如大腸桿菌(E.coli)廣 泛用作宿主用于經(jīng)由重組DNA(rDNA)技術(shù)生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，因 為它們可以很容易在分批發(fā)酵方法中生長(zhǎng)，且因?yàn)樗鼈冊(cè)谶z傳上是充 分表征的。然而，許多哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)需要一定類(lèi)型的翻譯后加工。 如果這些蛋白質(zhì)由例如大腸桿菌基因工程產(chǎn)生，那么翻譯后加工通常 必須使用復(fù)雜的、體外化學(xué)操作來(lái)完成，這對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用是成 本高昂的。即使當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主重組生產(chǎn)肽時(shí)，通常也需要有效 生產(chǎn)只在稍后對(duì)其實(shí)施進(jìn)一步修飾的前體。

一種類(lèi)型的此類(lèi)進(jìn)一步加工活性涉及肽或蛋白質(zhì)的羧基末端氨 基酸的特異性酰胺化。許多天然存在的激素和肽包含此類(lèi)修飾，如果 蛋白質(zhì)將是生物學(xué)活性的，那么所述修飾通常是必需的。一個(gè)例子是 降鈣素，其中用非酰胺化脯氨酸殘基替代天然形式的酰胺化脯氨酸導(dǎo) 致生物學(xué)活性非常顯著的減少。為了完全活性需要翻譯后酰胺化的其 他生物學(xué)肽包括但不限于生長(zhǎng)激素釋放因子、其他降鈣素、降鈣素基 因相關(guān)肽、促胰液素、肽YY等。

蛋白質(zhì)的羧基末端氨基酸的特異性酰胺化通常由α酰胺化酶催 化。為了最大功效需要酰胺化的許多重要的生物學(xué)蛋白質(zhì)的多肽序列 可以例如通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)制造。然而，重要的和有時(shí)必需的羧基 末端酰胺化通常必須在體外進(jìn)行。在這點(diǎn)上需要避免昂貴且繁瑣的化 學(xué)酰胺化技術(shù)，并且因此需要采用酰胺化酶來(lái)執(zhí)行特異性的酰胺化。

肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(PAM)催化肽底物轉(zhuǎn)化為酰胺 化的肽產(chǎn)物。該轉(zhuǎn)化是2步反應(yīng)。PAM具有2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域：肽基 甘氨酸α-羥基化單加氧酶(PHM)催化步驟1(底物轉(zhuǎn)化為中間體) 和肽基甘氨酸α-羥甘氨酸α-酰胺化裂合酶(PAL)催化步驟2(中 間體轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物)。全長(zhǎng)的PAM催化2個(gè)步驟。

在自然界中，大約50％的肽激素和神經(jīng)遞質(zhì)以前述方式由PAM 酰胺化。PAM活性已在眾多不同物種中識(shí)別出來(lái)，并且在不同的物 種如大鼠、母牛和青蛙中往往具有顯著的結(jié)構(gòu)同源性。還已知PAM 的功能、底物和輔因子在物種之間是相似的(通常相同)。底物是具 有含有游離羧基的甘氨酸殘基的化合物，通常是肽。PAM催化的酰 胺化反應(yīng)是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，在美國(guó)專(zhuān)利6,103,495中詳細(xì) 描述了一種反應(yīng)，其中使用肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶催化甘氨 酸延伸型鮭魚(yú)降鈣素前體轉(zhuǎn)化為在其C末端酰胺化的真正的鮭魚(yú)降 鈣素(即，具有替代前體C末端甘氨酸的氨基)。

由于酶的失活，PAM的活性在酰胺化反應(yīng)的過(guò)程中迅速減少。 為了預(yù)防此類(lèi)失活，現(xiàn)有技術(shù)的酶促酰胺化反應(yīng)一般需要第二種酶 (例如過(guò)氧化氫酶或辣根過(guò)氧化物酶)用于良好的轉(zhuǎn)化和反應(yīng)得率。 然而，這消極影響了該方法的成本和效率，并且從調(diào)節(jié)立場(chǎng)上通常是 不合需要的。例如，過(guò)氧化氫酶是大的蛋白質(zhì)，它難以純化，并且它 可能被不需要的蛋白酶污染，所述蛋白酶在酰胺化反應(yīng)中可以攻擊任 何產(chǎn)物、前體和/或酶。在藥物產(chǎn)物的情況下與過(guò)氧化氫酶共同純化 的蛋白質(zhì)還可超過(guò)調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)地污染最終產(chǎn)物。此外，當(dāng)過(guò)氧化氫酶來(lái) 自動(dòng)物來(lái)源時(shí)，或當(dāng)過(guò)氧化氫酶制造中使用動(dòng)物組分時(shí)，必須特別小 心以避免傳染性海綿狀腦病。

發(fā)明概述