[發明專利]用于集成連續生產生物分子的裝置和方法

有效

• 申請號: 200580033177.0
• 申請日: 2005-09-30
• 公開（公告）號: CN101076347A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發明（設計）人: 詹斯·沃格爾;羅伯托·喬瓦尼尼;康斯坦廷·B·康斯坦蒂諾夫;洪·恩古延;吳澎
• 申請（專利權）人: 拜爾醫藥保健有限公司
• 主分類號: A61K38/00
• 分類號: A61K38/00;B01D61/00;B01D61/02;B01D61/08;B01D61/14;B01D15/00;B01D15/04;B07B7/00;B07B7/02;B07B11/04;B07B11/06
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 封新琴;巫肖南

技術領域

本發明涉及用于從分子的異質混合物中純化目標分子的改進的方法和系 統。更具體地，本發明針對用于在來自連續灌流發酵過程的組織培養流體料 流(feedstream)中純化目標蛋白質的方法。

背景技術

熟悉本領域的人員公知的是，近年來已經建立的若干連續的細胞培養過 程，也稱為連續灌流過程(continuous?perfusion?process)，獲得很大的商業成功。 然而，連續灌流發酵之后的分離過程一般是分批的過程，并在物理上和計算 上(logistically)與連續的上游過程分離。在這些過程中，分離步驟的主要目的 是從大體積的相對稀釋的培養物上清液中捕獲產物。對于過程計算和空間要 求，必須強調產物的濃度，而同時除去雜質(純化)對于使所需的進一步下 游純化步驟數的最小化是重要的。

附圖1顯示了連續灌流發酵分離過程的典型現有技術的示意圖，這是熟 悉本領域的人員公知的。所述連續灌流發酵系統包括細胞滯留(cell?retention) 裝置(1)，其將產生產物的大多數細胞保持在發酵系統中。來自所述連續灌 流系統的連續的收獲流仍然含有一些細胞、碎片和其他顆粒，使用收獲泵(2) 將它們泵送到大的收集容器(3)中，例如不銹鋼罐。這些收獲物保存容器通 常必須被冷卻以將由于降解引起的產物損失保持在可行的范圍內。

一旦收集了特定的體積，其一般是1-4天或更久以后，將收獲物收集容 器從無菌發酵容器斷開，收集的材料被稱為一個收獲物批次。下一個步驟是 除去細胞、碎片和顆粒(步驟2)。在工業規模中，一般使用離心(4)繼之 以死端(dead-end)膜過濾(5)，或通過死端深度過濾(6)繼之以死端膜過濾 (7)來進行。有時使用的另一種技術是切向流(或“交叉流(crossflow)”)微 濾。在任何情況下，顆粒去除過程的產物是澄清組織培養流體的批次，或cTCF (8)。對于生物技術產物的顆粒分離的更多細節可以在標準教科書，例如 Biotechnology，Vol.3，Bioprocessing，Wiley-VCH，第2版(1996)，ISBN： 3527283137中找到。

在下一個步驟(步驟3)中，將澄清的組織培養流體的批次進一步加工 來濃縮和，如果可能的話，來純化產物。這一般通過交叉流超濾或通過填充 床層析來進行。

對于交叉流超濾來說，將cTCF泵入到系統的再循環罐(9)中。使用(10) 泵來推動材料通過交叉流超濾器。通過膜保持產物并作為滯留物再循環到再 循環罐中，而水和較小的雜質由于超濾模塊中的壓降產生的跨膜壓力被推過 膜進入滲透物(11)。在每次通過過濾器時，cTCF因此得到更多濃縮，總cTCF 體積被降低直到達到期望的濃縮因數。一旦達到了期望的濃縮因數，將過程 停止，并將保持的濃縮物體積(分離物)從系統中排出并收集。用于濃縮生 物技術產物的交叉流超濾的更多細節可以在標準教科書中找到，例如， Biotechnology，Vol.3，Bioprocessing，Wiley-VCH，第2版(1996)，ISBN： 3527283137。

對于填充床層析來說，將cTCF泵送到含有填充的樹脂床的層析柱(12) 上。產物與樹脂結合，然后使用適合的洗脫緩沖液(14)以通常的濃縮和純 化的形式(分離物，13)洗脫，在這之后使用足量的緩沖液和清洗溶液(14) 清洗和再生柱子。

被建議用于cTCF的濃縮/純化的其他層析變體是膨脹床層析和膜層析。 膨脹床層析可以處理含有顆粒的溶液。然而，雖然過濾面積降低了，層析之 后仍然需要過濾分離物。膜層析使用了修飾的微濾膜的層疊來取代填充的樹 脂床。益處是，傳質主要是對流的而不是擴散的，這容許更快的分離。此外， 該過程通常等同于標準填充床層析。用于濃縮和純化生物技術產物的層析的 更多細節可以在標準教科書中找到，例如，Protein?Purification，Principles， High-Resolution?Methods，and?Applications，Wiley-VCH，第2版(1998)，ISBN 0-471-18626-0。

通常，然后冷凍和保存批量(bulk)分離物用于以后在其它下游純化步 驟中使用。

因而，如上所述，分離過程一般是分批的過程，并在物理上和計算上與 連續的上游過程分離。并且，雖然發酵必須無菌地進行，但分離(即顆粒去 除和濃縮/純化)基本上是潔凈地、而不是無菌地進行。