[發明專利]神經干細胞

有效

• 申請號: 200580025096.6
• 申請日: 2005-06-09
• 公開（公告）號: CN101124319A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發明（設計）人: L·孔蒂;S·M·波拉德;A·G·史密斯
• 申請（專利權）人: 愛丁堡大學管理處
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 范征

本發明涉及神經干細胞以及培養神經干細胞(NS細胞或NSC)以促進干細胞的對稱分裂和自我更新的培養條件和方法。也提供了組合物、細胞群體、細胞系和單個神經干細胞。

雖然據說神經干細胞可在體外分離自多種來源，但迄今仍不可能在對稱分裂、未分化狀態的大規模培養中擴展細胞。從實驗和治療觀點來看，都非常需要使在此狀態中長期擴展細胞。獲得的純神經干細胞群體能夠定向分化為三種細胞類型：神經元、星形細胞和少突膠質細胞。

培養神經干細胞(雖然作為不均一細胞群體的一小部分)的一種已知方法是神經球(neurosphere)系統。此系統包括連續傳代不均一的細胞聚集體，其中僅有一小部分是真正的神經干細胞。神經球中的大多數細胞是定型祖細胞。

有許多關于神經球的不均一性和不穩定性，以及它們產生神經元的能力有限的報道(如Morshead等，2002)。Rappa等，Neuroscience?2003報道了以下方法：將神經球細胞平板接種在纖連蛋白上1-7天以轉染神經球細胞，然后重建神經球但不提供神經球內干細胞(如果有)的顯著表征。

Suslov等，2002提供了明確數據證明，神經球系統太不均一，以致于不能有意義地表征其中的任何干細胞。主要結論是，神經球內不僅不均一-″顯示克隆內神經細胞譜系多樣性，即除NSC以外，它們含有不同分化狀態的神經元祖細胞和神經膠質祖細胞″-而且不同克隆神經球品系之間的基因表達型存在很大差異。正如論文中明確確認的那樣，Suslov的基因表達型分析沒有建立神經球內干細胞的定義：-“獲得的分子表型表明我們系統中的產克隆NSC是不均一的，其中的亞組反映出不同的神經發育定型”。

本領域的許多文獻描述了膠質細胞的特性。Skogh等，MCN?2001描述了表達GFAP以及對RC2和干蛋白染色易變的膠質細胞培養物-應注意，在體內，放射狀膠質中不表達小鼠GFAP(Rakic，2003)。他們報道，他們的細胞不表達神經原性放射狀膠質的標記Pax6(Malatesta等，2001，2003)，他們沒有檢測到其它放射狀膠質標記。他們有不均一的培養物，沒有進行克隆分析。

關于體外放射狀膠質的其它報道認為它們是分化中間體或最終產物。因此，Bibel等(Nat?Neurosci，2004)報道了從ES細胞通過瞬時放射狀膠質樣細胞產生神經元，Gregg和Weiss(J?Neurosci，23：11587-601，2003；美國專利公開2003/0032181)描述了神經球細胞″分化″為放射狀膠質。Hartfuss等(Dev?Biol，2001)證明，放射狀膠質存在于神經球。

Gregg和Weiss發現，放射狀膠質是神經球的分化產物，可以斷定“這些結果表明神經干細胞可產生RGC[放射狀膠質細胞]和成年動物CNS中可重演(recapitulate)RGC指導的遷移”。流行的觀點是：放射狀膠質是神經球產生的分化細胞類型之一。

Liour和Yu(Glia，2003)證明，放射狀膠質細胞分化可獲自ES細胞，但本領域的其它報道沒有提到神經原性放射狀膠質的擴展。

Gobbel等，Brain?Res?2003報道了多能大鼠細胞能增殖為“松散地粘附于基材上生長的細胞的球狀簇″，即不形成均一的單層。而且，此論文的摘要斷定：“這些細胞在3次分裂中大約兩次產生有絲分裂后細胞，因此使擴展困難”。

他們的培養物中廣泛出現產膠質細胞的分化，但作者發現“相對少”(＜3％)神經元。他們沒有提供細胞的分子表型。

WO?01/30981描述了可分化為神經元的細胞的培養物。但這些細胞是GFAP和干蛋白陽性，被描述為星形膠質細胞，是相對不純的混合群體。

干細胞需要特定細胞微環境或小生境的觀點是干細胞生物學中的正統觀點。雖然不總是承認，但已知神經球干細胞僅構成祖細胞、母細胞和未成熟的分化后代等全部細胞中的一小部分。此種混合細胞類型的聚集可構成其中可能有干細胞的小部分細胞的小生境。

文獻中沒有報道過由ES細胞產生神經干細胞的均一群體，僅產生可能在變為膠質細胞限制性之前瞬時擴展的神經上皮前體細胞(如Brustle等，Science?1999)。

因此，本領域中存在許多問題。

所有報道都承認他們的培養物是不均一的。不可能用神經球系統維持對稱分裂和不分化狀態的神經干細胞的大規模培養。培養大量神經干細胞的其它嘗試沒有成功地超過5-20代，細胞高度傾向于分化也阻礙了這些嘗試。例外是有關成年大鼠海馬干細胞的工作，但這些是染色體組型異常，并且低效率地形成神經元。