[發明專利]核酸分析方法

無效

• 申請號: 200580019164.8
• 申請日: 2005-06-09
• 公開（公告）號: CN101120098A
• 公開（公告）日: 2008-02-06
• 發明（設計）人: C·W·福勒;J·R·納爾遜
• 申請（專利權）人: 通用電氣醫療集團生物科學公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07H21/02;C07H21/04
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 程淼;梁謀

相關申請的交叉引用

本申請要求以下美國專利申請的優先權：10/772,996，10/773,000， 二者均于2004年2月5日提交；10/651,362，10/651,355，10/651582， 10/651,558，均于2003年8月29日提交；10/358,818，于2003年2月5 日提交；10/113,030，10/113,025，二者均于2002年4月2日提交； 10/230,576，2002年8月29日提交；和美國臨時專利申請60/578,789， 于2004年6月10日提交；將其公開內容全文引入本文供參考。

發明領域

本發明一般地涉及樣品中多核苷酸的測序方法，所述方法基于使用 標記的核苷酸作為核酸聚合酶的底物。

發明背景

DNA聚合酶是適用于許多重組DNA技術的酶類，諸如通過聚合酶 鏈式反應(“PCR”)的核酸擴增、自動維持序列復制(“3?SR”)和DNA 測序。熱穩定性DNA聚合酶類是特別有用的。因為加熱不會破壞聚合 酶活性，所以不需要在每次變性步驟后添加另外的聚合酶。

已知在其催化性循環中，一旦“正確的”dNTP或ddNTP在活性位 點結合，則形成的DNA聚合酶-DNA復合物進行從“開放”到“閉合” 態的限速、構象轉變。在“閉合”態中，Mg²⁺或其它金屬離子)介導 了一種快速化學步驟，其涉及由引物末端的3‘羥基親核置換焦磷酸。 一旦焦磷酸釋放則該酶回到“開放”態并且易位發起下一輪反應。盡管 該三元復合物(酶-DNA-dNTP(或ddNTP))可在沒有Mg²⁺(或其它 金屬離子)的情況下形成，但是其僅在存在Mg²⁺(或其它金屬離子)的 情況下才擅長于核苷酸的化學加成。缺乏Mg²⁺(或其它金屬離子)的條 件往往導致第一“正確”的dNTP在緊密三元復合物中的非共價(物理) 螯合(Doublie等(1999年2月15日)Structure?Fold.Des.，7(2)：R31-5)。

發明概要

本發明利用以上觀察，采用該閉合復合物在DNA合成期間冷凍聚 合酶，捕獲與下一模板核苷酸互補的核苷酸，從而允許確定下一個正確 核苷酸的身份。其隨后可作為復合物的一部分被在適當位置(in?place) 鑒定，或者當反應循環由二價金屬離子的加入而完成時隨著染料從復合 物洗脫而被鑒定。DNA的按順序存在的核苷酸可通過這種方式被鑒定， 從而有效確定DNA序列。該方法可用于模板核酸的單個分子或用于同 一(或幾乎同一)序列的集合如PCR產物或克隆。若需要的話，多個模 板可被平行測序，尤其是它們被有效地固定在例如平板或珠粒的固體支 持物上時。

圖簡述

圖1描述了在目標陣列的閉合復合物階段通過磷酸標記的核苷酸中 止進行平行測序的反應方案。復合物在沖洗和掃描的全部時間范圍內是 穩定的。

圖2描述了在閉合復合物階段通過磷酸標記的核苷酸中止進行測序 的反應和檢測方案。復合物在沖洗和檢測的全部時間范圍內是穩定的。

圖3描述了在閉合復合物階段通過磷酸標記的核苷酸中止進行測序 的反應和檢測方案。復合物在沖洗和檢測的全部時間范圍內僅是部分穩 定的。獲得的序列不能區分序列中堿基倍數(A、AA、AAA等)。

圖4描述了在目標陣列的閉合復合物階段通過磷酸標記的核苷酸中 止進行平行測序的反應方案。復合物在沖洗和檢測的全部時間范圍內僅 是部分穩定的。獲得的序列不能區分序列中堿基倍數(A、AA、AAA等)。

圖5顯示了采用熒光標記的核苷酸形成穩定閉合復合物的證據。其 清楚地論證了該復合物可以如本文所述被檢測。

圖6展示了SDS是如何破壞閉合復合物的。

圖7展示了閉合復合物的聚合酶滴定。

定義

本文定義的術語“核苷”是包括嘌呤，去氮雜嘌呤，嘧啶或在1′位 或等價位置上連接到糖或糖取代基(substitute)，如碳的環或非環的部 分上的經修飾堿基，包括2′-脫氧和2′-羥基以及2′，3′-二脫氧形式以及其 它取代。

本文定義的術語“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，其中的酯化位點通 常對應于連接到戊糖的C-5位上的羥基。