[發(fā)明專利]核酸分析方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200580019164.8
• 申請日: 2005-06-09
• 公開（公告）號: CN101120098A
• 公開（公告）日: 2008-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: C·W·福勒;J·R·納爾遜
• 申請（專利權(quán)）人: 通用電氣醫(yī)療集團生物科學公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07H21/02;C07H21/04
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 程淼;梁謀

1.一種鑒定核酸模板的目標區(qū)域的方法，包括：

a)通過形成反應(yīng)混合物，在支持物上啟動核酸聚合反應(yīng)，所述反應(yīng) 混合物包含核酸模板、引物、核酸聚合酶、和至少一種各自含有不同標 記的末端磷酸標記的核苷酸，其中所述反應(yīng)混合物的組分或兩種或多種 所述組分的第一復合物被固定在所述支持物上，并且一種或多種所述組 分選自所述核酸模板、所述引物和所述核酸聚合酶，且其中所述至少一 種末端磷酸標記的核苷酸各自均含有與四種天然存在的堿基中的每一種 互補的堿基；

b)進行核酸聚合反應(yīng)，通過在沒有二價陽離子的情況下溫育所述反 應(yīng)混合物以形成包含所述核酸模板、所述引物、所述核酸聚合酶、和末 端磷酸標記的核苷酸的第二復合物進行，其中所述末端磷酸標記的核苷 酸含有與聚合位點處模板堿基互補的堿基；

c)除去未結(jié)合的末端磷酸標記的核苷酸和所述反應(yīng)混合物的其它組 分；和

d)檢測來自所述第二復合物的所述末端磷酸標記的核苷酸的標記。

2.權(quán)利要求1的鑒定核酸模板的目標區(qū)域的方法，還包括：

e)加入二價陽離子以完成所述聚合反應(yīng)；

f)除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；和

g)重復步驟(a)-(f)以確定序列中額外的核苷酸。

3.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟在流通或停止-流動系統(tǒng)中以 順序方式執(zhí)行。

4.權(quán)利要求1的方法，其中所述支持物是珠粒形式。

5.一種對多個核酸模板的目標區(qū)域進行平行鑒定的方法，包括：

a)在支持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物或核酸模板，其中各引物或模板均 含有獨特的序列，且其中各引物或模板的多個拷貝位于所述支持物結(jié)構(gòu) 上的可識別的離散位置；

b)通過形成反應(yīng)混合物，在所述支持物結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反 應(yīng)，所述反應(yīng)混合物包含所述多種引物、所述多種核酸模板、核酸聚合 酶、和至少一種各自含有不同標記的末端磷酸標記的核苷酸，其中每一 種所述至少一種末端磷酸標記的核苷酸均含有與四種天然存在的堿基中 的每一種互補的堿基；

c)進行所述核酸聚合反應(yīng)，通過溫育所述反應(yīng)混合物以形成多種復 合物，其各自均含有所述多種引物之一、所述多種核酸模板之一、所述 核酸聚合酶、和末端磷酸標記的核苷酸，其中所述末端磷酸標記的核苷 酸含有與聚合位點處模板堿基互補的堿基；

d)除去未結(jié)合的末端磷酸標記的核苷酸和所述反應(yīng)混合物的其它組 分；

e)在所述各可識別的離散位置檢測來自所述復合物的所述末端磷酸 標記的核苷酸的不同標記；

f)將從步驟e)獲得的數(shù)據(jù)記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；和

g)通過將所述數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為所述四種核苷酸序列之一，鑒定出所述多 個核苷酸模板的每一個的所述目標區(qū)域序列。

6.權(quán)利要求5的對多個核酸模板的目標區(qū)域進行平行鑒定的方法， 還包括：

h)加入二價陽離子以完成所述聚合反應(yīng)；

i)除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；和

j)重復步驟(a)-(i)以鑒定出所述多個核酸模板的每一另外的核 苷酸。

7.權(quán)利要求5的方法，其中所述支持物結(jié)構(gòu)是珠粒，且其中攜帶 一種引物的所述珠粒與攜帶不同引物的所述珠粒以可識別的方式分開。

8.權(quán)利要求1或5的方法，其中所述支持物結(jié)構(gòu)是顯微載玻片的 第一表面。

9.權(quán)利要求1或5的方法，其中所述末端磷酸標記核苷酸中所述 標記是熒光染料或生色染料。

10.權(quán)利要求9的方法，其中所述熒光染料選自夾氧雜蒽染料、花 青染料、merrocynine染料、偶氮染料、卟啉染料、香豆素染料、bodipy 染料和其衍生物構(gòu)成的組。

11.權(quán)利要求9的方法，其中所述生色染料選自偶氮染料、 merrocynine染料、花青染料、夾氧雜蒽染料、卟啉染料、香豆素染料、 bodipy染料和其衍生物構(gòu)成的組。