[發明專利]檢測DNA點突變的方法（SNP分析）和相關的裝置

有效

• 申請號: 200480021969.1
• 申請日: 2004-05-28
• 公開（公告）號: CN101094923A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發明（設計）人: 沃爾特·岡布雷赫特;彼得·波里卡;曼弗雷德·斯坦澤爾
• 申請（專利權）人: 西門子公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12P19/34
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 巫肖南;封新琴

本發明涉及檢測DNA點突變(SNP分析)的方法，其中利用了待測目標DNA與位于DNA芯片上的位置特異性固定化的捕手DNA的結合(雜交)。

利用雜交技術進行DNA分析是一種公知的方法(見“基因技術方法”，G.Gassen和G.Schrimpf，海德堡光譜學院出版社，1999，第11章，“印跡方法和雜交”，243到261頁)。在固態(fest)的載體材料上固定有DNA探針分子，所謂捕手(F_inger)寡核苷酸，由于其與互補的探針DNA的特異性親和性，捕獲互補的探針DNA，其中它們形成雜交體，即捕手和目標分子的配對。這種結合事件通常通過光學的或酶學的報告分子來顯示。

這種DNA分析的應用為例如傳染病病原體，如肺結核或HIV的檢測。對DNA分析的一個特別需求通過所謂“單核苷酸多態性”，縮寫為SNP′s建立起來。在此必須的是，由約20個不同核苷酸組成的捕手分子選擇性地結合或不結合目標分子，所述目標分子僅在一個唯一的核苷酸上有所區別。因為結合能上的區別非常小，對DNA傳感器(Sensor)的選擇性的要求非常高。

DNA傳感器是現有技術公知的，對此，可以參閱例如申請人未預先公開的DE10259820A1和DE10259821A1。捕手/目標DNA雜交體的結合在特殊的邊界條件(Randbedingungen)下發生，而彼此相配的捕手/目標DNA對與那些含有錯誤堿基配對的相比有更高的結合能量。由于SNP中細微的結合能量差別使得“完美匹配”和“單個位點錯配”常常不能被清楚地區分。

通過在現有技術的分析方法中引入了所謂“嚴格洗滌步驟”，后一個難題現在已被解決，即，選擇洗滌溶液的離子強度以使非特異性結合的“單堿基錯配”目標分子首先從捕手物上分離，而“完美匹配”的目標分子繼續結合在捕手分子上。同樣，昂貴的光學熔點分析也是可能的。在這種方法中人們利用了DNA雙鏈熔解時光吸收的內在改變，并且光學標記不是必需的。無論在嚴格洗滌還是在光學熔點分析中(在這兩種方法中除了需要相對大數量的DNA之外，用于對液相進行檢測的分光光度計也是必不可少的)，最多只能對單個SNP調整條件。當在傳感器芯片上存在多個SNP時，分離所有錯配是不可能的。

在對于熔解曲線的光學檢測中，通常無法提供用于連續測量或反復測量所必需的光學信號(DNA或標簽本身的活性)的穩定性。這同樣適用于不可逆的檢測方法。特別不可缺少的是，在能對其進行光學挑選之前，嚴格洗滌后必須對芯片進行干燥。

在″An?Active?Microelectronics?Device?for?Multiplex?DNA?Analysis″，M.Heller，IEEE?Engineering?in?Medicine?and?Biology，March/April?1996，第100到104頁中，進一步描述了一種所謂的“電嚴格處理”，其中在裝有電極的芯片上進行雜交。單一位點錯配的雜交體由于DNA的多聚陰離子特性通過電極的負極化被分離。然而這種方法不能作為可靠和通用的方法建立起來。此外，在這種方法中，為了能調整獨特的電學條件，如電勢，并且或許脈沖時間和強度，必需精確的了解各自的SNP-能量差別。通過應用富含能量的脈沖，DNA可能被損壞。

因而得出本發明的任務是，提出一種容易的和可靠的、又是細致(schonend)的和可逆的方法，在過程中可以安全地檢測具有不同的、理想地還具有未知的熔解溫度的多個SNP，和得到用于實施該方法的相關裝置。

根據本發明，通過根據權利要求1的方法步驟的順序，解決了該任務。有利的進一步的方案在從屬的方法權利要求中給出。

用于實施根據本發明的方法的相關裝置是權利要求28的主題。該裝置的進一步的方案在從屬的產品權利要求中給出。

在特定的進一步的方案中，根據本發明的方法有利地利用了電化學檢測方法，特別是氧化還原循環法與酶標記或酶學放大相組合的方法。在此使用的酶優選的具有熱穩定性。DNA捕手分子位于固定的載體材料上，優選的是硅芯片或裝有電極的絕緣體。

所述根據本發明的裝置至少含有對芯片雜交位置進行流體溫度控制或調節的設備，以及用于調節流體流速的設備和相關的檢測手段。具體的，進一步連接了具有包括精密泵的微流系統(Mikrofluidiksystem)的傳感器芯片。

從以下實施例的附圖說明可以看出本發明的進一步的細節和優點。