[發明專利]給基質提供具有現成的均勻分布的細胞外基質的方法

無效

• 申請號: 02141356.8
• 申請日: 2002-06-04
• 公開（公告）號: CN1400306A
• 公開（公告）日: 2003-03-05
• 發明（設計）人: A·邁爾斯;S·R·伊爾斯利;F·J·馬努扎
• 申請（專利權）人: 貝克頓迪肯森公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12M3/00
• 代理公司: 上海專利商標事務所
• 代理人: 徐迅

背景技術

1.發明的領域

本發明涉及提供一種獨特的細胞培養基的方法。更具體地說，本發明涉及從細胞培養裝置中提取液體的方法，所述的裝置包括粘附在基質上的均勻分布的胞外基質。

2.相關的背景技術

存在于細胞間的纖維狀和球形蛋白質的網狀系統稱之為胞外基質(ECM)。ECM是細胞環境的一種重要組成部分。細胞分泌的各種ECM成分形成基質間質和基質膜，在體內細胞錨定在該構架上。這些結構提供了組織特異性組織學的機體形成和發展所需要的空間定位和穩定性。然而，ECM并不僅僅是無活性的支架，而是一種在調節細胞的生長和分化中的必需物。ECM提供了一種環境，在正常的病理重新成型過程中(如胚胎發育，組織修復，炎癥，腫瘤侵入和轉移)調節細胞功能時扮演著重要角色。例如，ECM對生長因子的誘導，結合，儲存和呈遞功能是公知的。

認識到ECM是在細胞微環境的重要組成成分這一事實后，越來越多的研究者正將細胞外基質摻入到它們的細胞培養系統。ECM的體外應用，給細胞提供盡可能接近于它們在體內的生理環境狀態。ECM為細胞提供機械支撐，并通過提供生物化學信息(所述信息通過細胞表面受體而影響細胞)，影響細胞的行為。

基質膜是一種特殊類型的胞外基質，主要由層粘連蛋白和IV型膠原構成。從Englelbreth-Holm-Swarm老鼠瘤提取的著名的基質膜基質，以MATRIGEL^的商品名稱出售。這種老鼠瘤富含基質膜蛋白質。這種基質的主要成分是層粘連蛋白、IV膠原、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，也含有生長因子、基質金屬蛋白酶(MMPs[膠原酶])，和其他的蛋白酶(血漿酶原活化劑)，以及幾種未界定的化合物，但是并不含有可檢測水平的金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPs)。在室溫下，MATRIGEL^基質凝膠化并形成重構的基質膜，在結構、成分、物理性能和在體內保持功能特性的能力方面與活體基質膜相似。

已經使用MATRIGEL^基質開發了一些方法，從而在體外研究腫瘤細胞侵入基質膜基質的情況。典型的，這些方法涉及將MATRIGEL^基質包被在細胞培養插件(inserts)的微孔膜上。制備含有ECM的細胞培養體系的常規技術包括，首先加熱冰冷的、中性可溶膠原的溶液，以誘導天然的原纖維發生聚合和沉淀。在升高到4℃以上的溫度下保溫MATRIGEL^基質，可聚合這種基質。

然而，細胞培養中使用的無定型、化學交聯和堿性改性的膠原質膜常常被干燥，以改進儲存壽命并且不必每次使用前制備這種細胞培養基，因而制備含有天然的纖維膠原質的細胞培養基并僅僅使用天然纖維的固定的、粘著的凝膠的形式。這些凝膠通常按照上述方法生產，即通過加熱冰冷的、中性的可溶膠原溶液以誘導天然原纖維發生聚合和沉淀?？墒?，它們不能干燥儲存，因為早先使天然纖維膠原質凝膠收縮和干燥的作法導致了天然結構的喪失，次最佳的纖維形成和差勁的滲透性能。因此，必須在使用之前制備天然纖維膠原質的細胞培養基。這增加了采用天然纖維膠原質的細胞培養進行研究的勞力和不方便性。于是，存在一種對于含有天然纖維膠原(如在MATRIGEL基質中發現的天然纖維膠原質)的細胞培養基的需求，該培養基能夠在使用之前用制備物進行制備。

制備含有天然纖維膠原的細胞培養裝置的常規方法，在使用之前和凝膠聚合后希望清除殘存在基質中的液體。從ECM清除液體的常規方法包括空氣干燥和在提高的溫度下干燥。通常提高溫度的干燥條件包括在提高溫度的情況下采用干燥氣流的快速干燥，該方法可促進大的鹽結晶和更明顯的MATRIGEL基質模式。迅速的MATRIGEL基質干燥導致侵入細胞的分布不好。

常規液體清除技術也包括將多孔表面的下面放在吸附材料上一段時間(3分鐘到過夜)和/或對多孔表面使用溫和的真空。在緩慢的降低溫度和沒有空氣流的情況下緩慢清除液體，導致最均勻的包被層和侵入的細胞最均勻的分布。例如，Swiderek等人的美國專利5,731,417揭示了制造用于細胞培養的天然膠原干膜的方法，其中包括空氣干燥基質。

常規干燥方法降低了細胞培養裝置的功能。例如，常規包被和干燥方法通常導致不均勻或中斷的涂層，從而產生不均勻細胞的侵入，例如形成諸如侵入細胞顯著的中心點或環的等各種模式。因此，在顯微鏡下精確計算侵入細胞是十分困難的。另外，區別侵入和非侵入細胞的能力明顯降低。侵入細胞包括HT-1080細胞，而非侵入細胞包括NIH3T3細胞。因此，分布的纖維膠原基質例如MATRIGEL基質宜為均勻和密實的。

發明的概述