[發明專利]并行比較微生物群落結構的分子生態監測方法

無效

• 申請號: 02136206.8
• 申請日: 2002-07-25
• 公開（公告）號: CN1390951A
• 公開（公告）日: 2003-01-15
• 發明（設計）人: 趙立平;魏桂芳
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟

技術領域：本發明涉及的是一種微生物群落結構特征的分子生態監測方法，特別是一種并行比較微生物群落結構差異的分子生態監測方法，屬于微生物生態學領域。

背景技術：微生物在許多國民經濟生產部門中具有重要地位，例如生物醫藥(動物、人體保健)、生物農藥(植物內生菌)、輕工食品和環境保護等領域都是利用微生物進行生產活動的，而且在多數情況下，這些生產部門的生產活動所依賴的是多種微生物組成的微生物群落的功能。長期以來，在利用微生物生態系統進行生產活動的許多行業部門，受所使用的微生物分離培養技術的限制，無法全面、客觀認識系統中的群落成員，無法及時動態跟蹤系統成員種群數量變化對系統功能的影響，生產效率不僅低，而且不穩定。而通過分析微生物群落的總基因組DNA的組成，可以比較客觀地認識微生物群落的結構。可以用于微生物群落結構分析的基因組DNA的序列信息包括16S?rDNA(核糖體小亞基基因)序列、已知功能基因的序列、重復序列以及隨機基因組序列等。由于16SrDNA中包含了相應細菌種類的系統分類地位的信息，因此，以16S?rDNA為對象可以比較準確地分析微生物群落的種群結構組成。經文獻檢索發現：Susan?E.Pryde，Anyhony?J.Richardson，Colin?S.Stewart，and?Harry?J.Flint.1999.Molecular?Analysis?of?the?Microbial?Diversity?Present?in?the?Colonic?Wall，Colonic?Lumen，and?Cecal?Lumen?of?a?Pig.Appl.Environ.Microbiol.65：5372-5377，(對存在于豬的結腸壁、結腸內和盲腸內的微生物多樣性的分子分析。應用與環境微生物學，65卷，5372-5377頁。)一種常用的技術是構建基因文庫。例如，根據16S?rDNA在進化上的保守性特點設計具有不同專一性的通用引物，擴增環境中所有細菌或某一個類群細菌的16S?rDNA，將擴增產物克隆到載體上構建成基因文庫，通過分析一定數量的克隆子的序列以及它們的出現頻率，可以在一定程度上了解環境樣品中的主要細菌類群及其出現豐度等種群結構信息。這種方法需要進行克隆、測序等分子水平的工作，需要良好的實驗條件和專用設備，耗費人力、財力和時間都較大，難以在醫院、工廠等實際生產場所應用。另外，由于PCR擴增的偏好性，對生態系統樣品中的種群結構的測度準確性也不特別高。又發現第二種常用的依賴16S?rDNA的群落結構分析技術：Dicello?F.，Bevivino?A.，Chiarini?L.，Fani?R.，Paffetti?D.，TabacchioniS.and?Dalmastri?C.1997.Biodiversity?of?a?Burkholderia?cepacia?populationisolated?from?the?maize?rhizosphere?at?different?plant?growth?stages.Appl.Environ.Microbiol.63：4485-4493.(從不同生長期的玉米根際分離得到的洋蔥伯克霍爾德氏菌群的生物多樣性研究。應用與環境微生物學，63卷，4485-4493頁。)該技術是提取環境樣品中的總DNA，用通用引物擴增16S?rDNA，用各種限制性內切酶對擴增產物進行酶切分析，由于不同的群落內微生物種類組成不同，其酶切圖譜也就不同，這樣可以得到反映微生物群落結構組成特征的DNA凝膠電泳圖譜，由于這種方法只能從分子量大小上對酶切產物進行分離，當比較兩個不同微生物群落的結構差異時，圖譜相似的群落，其種群組成不一定相同。目前基于16S?rDNA擴增用的較多的還有通過溫度梯度凝膠電泳或變性梯度凝膠電泳分析PCR擴增得到16S?rDNA可變區(如V3區)序列的多樣性，從而反映微生物區系的復雜性。但這種方法也只能對大小為500bp以下的序列進行有效分離，而且當微生物種類過多時，同一個條帶可以包含多個種類的DNA信息，因此，不能做到在較高的分辨率下分析比較微生物群落結構的差異。

發明內容：本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種并行比較微生物群落結構差異的分子生態監測方法，所涉及用rep-PCR(重復序列聚合酶鏈式反應)擴增技術及混合探針分子雜交的方法，同時比較各種生態環境中微生物群落結構的差異及同一生態系統中微生物種群結構的時空動態變化，使本發明所涉及的rep-PCR及混合探針雜交的技術具有簡便、快速、靈敏的特點，可同時分析比較多個微生物生態系統的結構差異及同一生態系統微生物種群結構的動態變化。