[發明專利]并行比較微生物群落結構的分子生態監測方法

無效

• 申請號: 02136206.8
• 申請日: 2002-07-25
• 公開（公告）號: CN1390951A
• 公開（公告）日: 2003-01-15
• 發明（設計）人: 趙立平;魏桂芳
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟

1、一種并行比較微生物群落結構分子生態的監測方法，其特征在于監測方法具體如下：

(1)選定rep-PCR引物；

(2)環境樣品中混合微生物總基因組DNA的提??；

(3)rep-PCR循環反應；

(4)rep-PCR產物純化，濃度測定；??

(5)純化產物標記為探針；

(6)待測生態系統微生物混合DNA的rep-PCR產物經1.2～1.5％瓊脂糖凝膠電泳；

(7)Southern-Blot檢測，即印跡雜交檢測。

2、根據權利要求1所述的這種并行比較微生物群落結構分子生態的監測方法，其特征是以下對監測方法進一步限定：

首先，根據報道的Rep序列，選擇適合于研究目標微生物生態系統的rep-PCR的引物，并確定PCR反應的循環程序，rep?PCR的25μLPCR反應體系中，含模板80ng，23mM?MgCl₂?2.5μL，2.5mM的dNTP?mix?2μL，20pmol的引物各1μL；

PCR產物經DyNA?quant200濃度測定后，取大約5μLPCR產物經MO?BIOUltraClean?PCR?Clean-up?DNA?Purification?kit純化，純化后經DyNA?quant200進行濃度測定；

探針標記體系含，純化后的PCR產物3μg，10×六核苷酸混合物2μL，dCTP、dGTP、dATP各1mM、dTTP?0.65mM、DIG-11-dUTP?0.35mM的dNTPsmix?2μL，2u/μL的klenow酶1μL，水補足到20μL，37℃標記20h，反應結束后加4M?LiCl2μL，0.2M?PH?8.0的EDTA2.5μL，75μL冰冷的無水己醇，混勻后-20℃沉淀至少2h，之后14,000rpm/min離心30min，70％的己醇洗滴，14,000rpm/min離心30min，干燥后溶于50μL無菌水中；

待測目標微生物生態系統混合DNA的rep-PCR指紋圖譜，經1.2％或1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，真空轉跡于帶正電荷的尼綸膜上；真空轉跡、固定完畢后，將轉移膜浸于50ml?Blocking?solution中，該溶液組成為0.1M馬來酸，0.15MNaCl，1g?Blocking?reagent，PH7.5，將膜卷于雜交管中，68℃預雜交至少30min，變性DNA探針，沸水中煮10分鐘，大約500ng，立即置于冰鹽混合物中，用含有探針的雜交液20ml更換預雜交液60℃雜交至少10h，回收含有探針的雜交液，貯存于-20℃，每次用之前68℃變性10min，雜交完畢后，先用50ml?2×SSC，0.1％SDS室溫洗膜兩次，每次15min；再用50ml?0.5×SSC，0.1％SDS68℃洗膜兩次，每次15min，最后進行顯色反應。

3、根據權利要求2所述的這種并行比較微生物群落結構分子生態的監測方法，其特征是真空轉跡方法如下：

①真空轉跡框保持清潔干燥，與緩沖瓶、真空泵連接；

②將帶口的塑料膜置于支持膜上，去離子水預濕的濾紙和轉移膜，可以用硝酸纖維素膜或帶正電的尼綸膜，先后傾斜45度角緩緩鋪于塑料膜窗口下并完全覆蓋該窗口，排除任何氣泡；

③凝膠傾斜45度角緩緩置于塑料膜窗口上，排除凝膠與轉移膜間的氣泡；

④安裝頂框，以四個夾子對稱固定，打開真空泵固定凝膠；

⑤加足夠的溶液1，配方為去嘌呤液，0.25M?HCl，覆蓋凝膠，穩定真空泵在50mbar，所有進一步的處理均在50mbar進行；

⑥7min后，傾斜轉跡框，擁戴手套的手指輕輕去除凝膠表面液體；

⑦加足夠的溶液2，配方為變性液，1.5M?NaCl，0.5M?NaOH，覆蓋凝膠，同上，等待7min，徹底移走殘留的液體；

⑧加足夠的溶液3，配方為中和液，1.0M?Tris，1.5M?NaCl，PH7.5，覆蓋凝膠，同上，等待7min，徹底移走殘留的液體；

⑨加溶液4，配方為轉移液，20×SSC，轉移液覆蓋凝膠的厚度為凝膠厚度的兩倍，等待30～40?min，徹底移走殘留的液體；

⑩關閉真空泵，移走凝膠，取出膜，紫外固定5min，室溫干燥。

4、根據權利要求2所述的這種并行比較微生物群落結構分子生態的監測方法，其特征是顯色反應方法如下：

①在Washing?Buffer，配方為0.1M馬來酸，0.15M?NaCl，0.3％(v/v)Tween20，PH7.5，中簡短洗膜1～5min，然后在100ml?Blocking?Solution中輕搖30min；

②在20ml?Antibody?Solution中，輕搖30min，抗體以1∶5000稀釋于Blocking?Solution中；

③在100ml?Washing?Buffer洗膜兩次，每次15min；

④在20ml?Detection?Buffer，配方為0.1M?Tris，0.1M?NaCl，PH9.5，20℃，中平衡2～5min，用10ml新鮮配置的顯色液再暗處顯色，配方為加200μL的NBT/BCIP到10ml?Detection?Buffer中；

⑤顯色完畢后，將膜侵入去離子水中以終止反應，照相或掃描記錄結果。