[發(fā)明專利]菌血癥檢驗(yàn)用基因芯片的檢驗(yàn)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 02129315.5
• 申請(qǐng)日: 2002-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN1396272A
• 公開（公告）日: 2003-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃熙泰;侯亭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開大學(xué);天津南開基因工程有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 天津市學(xué)苑有限責(zé)任專利代理事務(wù)所
• 代理人: 趙尊生

所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及菌血癥檢驗(yàn)用基因芯片的檢驗(yàn)方法，特別是對(duì)血液中病原菌DNA的分離、靶基因DNA順序擴(kuò)增和鑒定的技術(shù)，由此可延伸到以基因芯片為基礎(chǔ)的人體、牲畜其它器官感染病菌檢測(cè)、環(huán)境、衛(wèi)生檢測(cè)及海關(guān)檢疫技術(shù)。

背景技術(shù)

正常人的血液是無菌的，當(dāng)細(xì)菌侵入血液時(shí)，可引起人類的菌血癥乃至敗血癥。此種病癥是一種嚴(yán)重而危急的全身性感染，細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)對(duì)疾病的防治具有極為重要的意義。

對(duì)血液中病原菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要有兩種，一種是最為傳統(tǒng)的培養(yǎng)、分離、鑒定系統(tǒng)，以無菌的方法采集靜脈血，立即注入適當(dāng)?shù)囊后w增菌培養(yǎng)基內(nèi)，作需氧或厭氧培養(yǎng)等。另一種是自動(dòng)血液分析、鑒定系統(tǒng)，以阿克蘇公司生產(chǎn)的BacT/Alert為例，BacT/Alert血培養(yǎng)系統(tǒng)是一種全自動(dòng)封閉式微生物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能自動(dòng)培育、振蕩、連續(xù)監(jiān)測(cè)來自菌血癥或真菌血癥可疑患者的厭氧及需氧血標(biāo)本。根據(jù)病菌生長(zhǎng)過程發(fā)生的生理、生化變化來判定有無菌感染以及菌的種類。要涉及多種培養(yǎng)介質(zhì)和多種檢測(cè)指標(biāo)。

目前的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)在血液中病原菌的分離及鑒定方面的現(xiàn)狀是工序煩雜、耗時(shí)長(zhǎng)，且有些病原菌不能被體外培養(yǎng)，因此現(xiàn)有的檢驗(yàn)方法陽(yáng)性檢出率低。

Anthony.R.M.et?al.(Rapid?diagnosis?of?bacteremia?by?universal?amplification?of?23sribosomal?DNA?followed?by?hybridization?to?an?oligonucleotide?array，J.Clinicalmicrobiology，F(xiàn)eb.2000.p781-788)，報(bào)道了對(duì)菌血癥迅速診斷方面的研究結(jié)果，設(shè)計(jì)出了探針陣列應(yīng)用于菌血癥的診斷。但是，其中包括的探針較少，覆蓋病原菌種類只有22個(gè)，會(huì)漏掉許多病原菌，而且準(zhǔn)確性差。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種菌血癥檢驗(yàn)用基因芯片的檢驗(yàn)方法，可以克服已有技術(shù)的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確的病原菌檢出。本發(fā)明以菌血癥檢驗(yàn)用基因芯片為基礎(chǔ)，對(duì)血液中的病原菌DNA進(jìn)行有效的分離、PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增和標(biāo)記靶DNA順序，通過標(biāo)記靶DNA順序與基因芯片上的探針陣列的雜交、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的分類檢出和鑒定，從而徹底摒棄現(xiàn)有的冗長(zhǎng)、繁雜的血液中病原菌的檢驗(yàn)方法。

本發(fā)明包括下述步驟：

1)、采集血液標(biāo)本，采血一次，采血量在0.1-0.5ml的范圍之內(nèi)。

2)、血樣中病原菌DNA的抽提：

取全血置于eppendorf離心管中，補(bǔ)加無菌水1ml在室溫下靜置5分鐘，然后于室溫下離心：14000×g，5分鐘，棄去900ul上清液，加入400ul裂解緩沖液(lysis?buffer，10mMTris.HCL?pH8.0，10mM?EDTA，0.5％SDS)混勻后加6ul?20mg/ml的蛋白酶K(Sigma或上海生工公司產(chǎn)品)，混勻，置56℃水浴中保溫30分，之后加等體積TE溶液飽和酚試劑，強(qiáng)烈震蕩后，于8000r/min室溫離心3分鐘，吸取上清液，重復(fù)酚抽提一次，吸取上清液，加1/10體積的甲醇納(3mol/l)，混勻，再加等體積冰冷異丙醇，混勻后再12,000rpm，室溫，離心5分鐘，傾去上清，加70％冰冷乙醇振蕩洗滌一次，室溫下12,000rpm，離心5分鐘，傾去上清，沉淀加50ulTE溶液溶解，置-20℃儲(chǔ)存。

3)、病原菌DNA靶順序的PCR擴(kuò)增和地高辛或熒光素標(biāo)記：

???1.靶順序擴(kuò)增的PCR體系：

????成分?????????????????濃度???????加樣量????反應(yīng)終濃度

????PCR?buffer???????????10X?????????5ul??????1X

????Mgcl₂???????????????25mM????????5ul??????2.5mM

????Taq?DNA?Polymerase???5u/ul???????0.3ul????0.03/u1

????引物I????????????????10uM????????2ul??????100nM

????引物II???????????????10uM????????2ul??????100nM

????引物III??????????????10uM????????2ul??????100nM

????引物IV???????????????10uM????????2ul??????100nM