[發(fā)明專利]菌血癥檢驗用基因芯片的檢驗方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 02129315.5
• 申請日: 2002-08-30
• 公開（公告）號: CN1396272A
• 公開（公告）日: 2003-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃熙泰;侯亭
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué);天津南開基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 天津市學(xué)苑有限責(zé)任專利代理事務(wù)所
• 代理人: 趙尊生

1、一種菌血癥檢驗用基因芯片的檢驗方法，其特征在于它包括如下步驟：

1)、血樣中病原菌DNA的抽提：

取全血血液樣品置eppendorf離心管中，加入無菌水1ml在室溫下靜置5分鐘，離心：14000×g，5分鐘，棄去900ul上清液，加入400ul含有Tris、HCL、EDTA和SDS的pH8.0的裂解緩沖液，混勻后加6ul?20mg/ml的蛋白酶K，混勻，置56℃水浴中保溫30分鐘，之后加等體積TE溶液飽和酚試劑，強(qiáng)烈震蕩后，于8000r/min室溫離心3分鐘，吸取上清液，重復(fù)酚抽提一次，吸取上清液，加1/10體積的甲醇納(3mol/l)，混勻，再加等體積冰冷異丙醇，混勻后再12,000rpm，室溫，離心5分鐘，傾去上清液，加70％冰冷乙醇振蕩洗滌一次，室溫下12,000rpm，離心5分鐘，傾去上清液，沉淀加50ulTE溶液溶解，置-20℃儲存；

2)、取第一步抽提樣品，加入PCR反應(yīng)體系：5ul?PCR?buffer，5ul?MgCL₂，2ul引物I，2ul引物II，2ul引物III，2ul引物IV，0.3ul?dNTP，0.3ul?Digoxigenin-11-dUTP，0.3ulTaq?DNA?Polymerase和16ul重蒸蒸餾水，使總反應(yīng)體積為50ul；把混合好的PCR待反應(yīng)物，放入PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

??引物I：5’-CCGATTTCAGATAGGTGCAATCT-3’

??引物II：5’-TACGCCATTCGCTCCCTGTAAT-3’

??引物III：5’-GTATCGACGATGAACGGAGC-3’

??引物IV：5’-TTCTCGGCATAATGATGTGA-3’

PCR擴(kuò)增條件：

首先在94℃，變性10min；然后94℃，30sec(30sec-1min)；57℃，15?sec；72℃，40sec，這樣進(jìn)行5個循環(huán)；而后，94℃，30sec，64℃，40sec，這樣進(jìn)行25個循環(huán)的反應(yīng)；最后在72℃，延伸5min；所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物帶有地高辛標(biāo)記，在4℃保存，留待以后進(jìn)行雜交；

3)、病原菌的鑒定：按上述擴(kuò)增出被測DNA樣品的靶DNA順序，與菌血癥檢驗用基因芯片雜交，雜交后的芯片經(jīng)抗地高辛的酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)，出雜交點(diǎn)顯色圖形，然后與標(biāo)準(zhǔn)菌模式圖數(shù)據(jù)庫中的點(diǎn)陣圖形相比對，即可確定病原菌的類型。

2、按照權(quán)利要求1所說的菌血癥檢驗用基因芯片的檢驗方法，其特征在于所說的裂解緩沖液是10mM?Tris.HCL?pH8.0，10mM?EDTA，0.5％SDS的溶液。

3、按照權(quán)利要求1所說的菌血癥檢驗用基因芯片的檢驗方法，其特征在于所說的全血血液樣品為0.1-0.5ml。

4、按照權(quán)利要求1所說的菌血癥檢驗用基因芯片的檢驗方法，其特征在于所說的菌血癥檢驗用基因芯片是以尼龍膜為基質(zhì)構(gòu)建的基因探針陣列構(gòu)成。

5、按照權(quán)利要求4所說的菌血癥檢驗用基因芯片的檢驗方法，其特征在于所說的菌血癥檢驗用基因芯片為：尼龍膜質(zhì)基因芯片尺寸為2.0cm×2.0cm，56個基因探針形成橫8行，豎7行的基因探針陣列(DNA-microarray)，上端和左側(cè)輔以判讀坐標(biāo)點(diǎn)；第一行的八個圓點(diǎn)，和第一縱列的九個圓點(diǎn)是本芯片的坐標(biāo)點(diǎn)，以溴芬蘭為主的蘭色標(biāo)記液點(diǎn)在尼龍膜上，在芯片的判讀過程中，作為判讀芯片的橫縱坐標(biāo)，對于56個探針點(diǎn)陣進(jìn)行定位(圖1)。